• ergotioneina
• diabete
• danno ossidativo
• antiossidanti
• estratto fermentato di papaia

L’accumulo di danni molecolari e cellulari, indotto dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS), è attualmente noto essere coinvolto nell’attivazione e nella progressione di diversi processi biologici e patologici, compresi: invecchiamento cellulare, patologie neurodegenerative, quali la malattia di Alzheimer ed il Parkinson, e di patologie croniche quali quelle cardiovascolari, l’insulino resistenza e non ultimo il diabete. Proprio per quest’ultima patologia le evidenze del coinvolgimento del danno ossidativo a vari tessuti e’ stato considerato non solo come fattore eziologico ma anche come fattore chiave per la sua progressione. E’ stato inoltre osservato che molti processi degenerativi possono essere prevenuti attraverso trattamenti con scavengers dei radicali liberi e con antiossidanti esogeni.
Nella ricerca di trattamenti sempre piu’ mirati e in grado di agire da fattori terapeutici, in questo lavoro di tesi abbiamo analizzato le capacita’ antiossidanti di due prodotti naturali; l’ergotioneina (EGT), sostanza naturale, sintetizzata da batteri del terreno sui substrati fungini, e l’estratto fermentato di papaia (FPP). In dettaglio, lo scopo di questa tesi e’ stato di verificare gli effetti dell’EGT e dell’FPP nella prevenzione degli effetti fisiologici indotti da danno ossidativo in un modello cellulare neurale in vitro di feocromocitoma di ratto (PC12) ed in un modello murino di fibroblasti di topo (C2C12).
La prima fase ha interessato lo studio dell’attivita’ antiossidante dei composti selezionati considerando la loro capacita’ di antagonizzare l’ossidazione dell’acido alfa-cheto-gamma-metilbutirrico del radicale idrossile, del perossile e del perossinitrato. I risultati sono stati espressi in Total Oxyradical Scavcenging Capacity (Unita' TOSC). L’EGT ha mostrato di essere il piu’ attivo antiossidante analizzato se confrontato con il GSH, l’acido urico e il Trolox, un analogo della vitamina E. In dettaglio, l’EGT ha mostrato di avere la capacita’ antiossidante piu’ alta verso il radicale perossile, mostrando un valore del 25% piu’ alto rispetto all’antiossidante di riferimento per questo radicale. La capacita’ di scavenger verso il radicale idrossile ha mostrato un valore del 60% piu’ alto rispetto all’acido urico. Per quel che riguarda la capacita’ di ridurre il radicale perossinitrato, anche in questo caso l’EGT si e’ dimostrato essere il piu’ efficacie. Analizzando l’effetto dell’FPP sulla capacita’ di ridurre il radicale perossile, idrossile e perossinitrato il quadro generale e’ risultato molto diverso. L’FPP infatti ha mostrato una elevata capacita’ di ridurre solo il radicale ossidrile, con un valore del 120% superiore all’antiossidante di riferimento, dimostrandosi un antiossidante piu’ specifico.
Passando successivamente all’analisi degli effetti dell’EGT e dell’FPP nei vari modelli cellulari, il primo passo e’ stato quello di analizzare l’effetto inibitorio nei confronti della citotossicita’ indotta dall’H2O2 nella linea cellulare PC12 e del PA, tramite il saggio dell’MTT, per le C2C12. Entrambe i pre-trattamenti con EGT e FPP sono stati in grado di ridurre l’effetto citotossico indotto dall’ossidante scelto ed in modo concentrazione-dipendente. I dati ottenuti con i saggi di vitalita’ cellulare hanno avuto perfetta correlazione con i risultati ottenuti analizzando le potenzialita’ di inibire il danno al DNA. Il saggio della Cometa, valutando in modo quantitativo i tagli a singolo e doppio filamento, ha evidenziato che sia per l’EGT che per l’FPP e’ presente una tendenza alla riduzione dell’endpoint preso in considerazione, che pero’ e’ risultata statisticamente significativa (P<0.001) solo per l'EGT.
Per poter avere maggiori informazioni sul meccanismo di protezione da danno citotossico abbiamo analizzato la possibile modulazione indotta ad alcune protein-chinasi intracellulari (MAPKs). Quello che e’ stato evidenzito e’ che, in presenza di danno ossidativo indotto da H2O2, l’EGT si comporta da inibitore della fosforilazione di p38 e da attivatore di fosforilazione per Akt, mentre nessun effetto e’ stato osservato per ERK1/2. In queste condizioni quindi l'EGT e’ plausibile che giochi un ruolo protettivo nella citotossicita; indotta da agenti ossidanti attivando meccanismi molecolari intracellualari in cui p38 e’ fattore determinante. Per la modulazione a carico dell’FPP, sulle MAPKs, quello che e’ stato possibile osservare e’ che tale sostanza, anche se in modo meno evidente che per l’EGT, e’ anch’essa capace di agire come modulatore di eventi di fosforilazione ma solo a carico di Akt. Nessun effetto significativo e’ stato invece osservato a carico di p38 e ERK1/2. Avendo presenti gli interessanti risultati ottenuti con l’EGT il passo successivo e’ stato quello di investigare in vitro il suo effetto protettivo/antiossidante in un modello di fibroblasti murini (C2C12) sotto l’azione ossidante dell’acido palmitico (PA). Le cellule sono state incubate a diverse concentrazioni di PA (PA; 250, 500, 750 e 1000 microM) per 24h preceduta da 24h di pre-trattamento con l'EGT. Tramite tale protocollo sperimentale abbiamo analizzato come endpoints cellulari, la citotossicita’ cellulare (saggio MTT), la modulazione di alcune protein-chinasi intracellulari (MAPKs) (Western blot) e l’effetto trascrizionale e traduzionale per il gene pro-infiammatorio IL-6. I risultati dell’effetto protettivo nei confronti della citotossicita’ indotta da PA hanno mostrato un evidente recupero, statisticamente significativo, sia per la vitalita’ che per la morfologia cellulare, ad entrambe le concentrazioni di EGT analizzate (500 e 1000 microM); dati in perfetta correlazione con quelli ottenuti con il modello cellulare PC12. Per quel che riguarda la modulazione delle MAPKs analizzate, anche per le C2C12, l’EGT si e’ “comportata” come inibitore specifico di p38 e Akt. Infine per la parte relativa all’IL-6, l’EGT ha agito da sostanza anti-infiammtoria inducendo un decremento, statisticamente significativo, della regolazione del gene analizzato sia a livello trascrizionale che traduzionale.
In conclusione i risultati, seppur parziali, ottenuti in questo lavoro di tesi, suggeriscono che (i) l’EGT e l’FPP svolgono un ruolo protettivo nei confronti della citotossicita’ indotta dagli agenti pro-ossidanti scelti (H2O2 e PA), (ii) che tale effetto implica la regolazione delle protien-chinasi intracellulari e che (iii) l’EGT e’ in grado di agire da sostanza antiinfiammatoria almeno nel modello cellulare analizzato.