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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-07032014-163636


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
LUBRANO, SIMONE
URN
etd-07032014-163636
Titolo
Identificazione di nuovi interattori funzionali di BRAFV600E tramite screening genetico in lievito Saccharomyces cerevisiae
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
relatore Dott.ssa Poliseno, Laura
relatore Dott.ssa Cervelli, Tiziana
Parole chiave
  • s. cerevisiae
  • melanoma
  • MAPK
  • lievito
  • BRAFV600E
  • BRAF
  • screening genetico
  • vemurafenib
  • yeast
Data inizio appello
21/07/2014
Consultabilità
Completa
Riassunto
Il melanoma è un tumore cutaneo maligno per il quale non esiste ancora una cura valida. Il 50% dei pazienti con melanoma presenta una specifica mutazione nel gene BRAF, che causa un’alterata regolazione del pathway MAPK (mitogen-activated protein kinase o RAS/RAF/MEK/ERK pathway), coinvolto nella divisione e differenziazione cellulare. Tale mutazione consiste nella sostituzione di una valina con acido glutammico in posizione 600 (BRAFV600E); ciò determina un cambio di conformazione, responsabile di un’attivazione costitutiva della proteina anche in presenza di un basso livello di RAS, il suo attivatore. Recentemente è stato sviluppato un farmaco, Vemurafenib (PLX4032), in grado di inibire in maniera specifica BRAFV600E e quindi di determinare la regressione del tumore in poche settimane. Purtroppo però, dopo circa 6 mesi, si presenta il fenomeno delle resistenza acquisita, con ricomparsa delle metastasi nel paziente ed una nuova progressione del tumore. Un meccanismo di resistenza acquisita noto è la formazione di varianti di splicing di BRAFV600E, tra cui la forma BRAFV600E∆[3-10].
Lo scopo della mia tesi è quello identificare nuovi interattori funzionali di BRAFV600E in modo da permettere lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i pazienti affetti da melanoma che mostrano tale mutazione di BRAF.
Per fare questo, ho utilizzato un pool di cloni di lievito S. cerevisiae, che presentano una delezione in geni non essenziali [yeast deletion pool (4.741 cloni)]. Ogni clone è identificabile tramite due sequenze specifiche di DNA denominate “barcode”. Attraverso l’uso dell’yeast deletion pool è possibile identificare interattori funzionali di proteine legate a malattie e che non hanno controparti omologhe nel lievito, come BRAF.
Per fare esprimere le varie forme di BRAF nell’yeast deletion pool, ho clonato ciascuno dei tre cDNA di BRAF (BRAFV600E; BRAFV600E∆[3-10]; BRAF wild type) nel vettore pYES2 contenente il gene di lievito URA3 come marcatore di selezione ed il promotore inducibile pGAL1 che permette l’espressione di proteine eterologhe solo in galattosio (in quanto il gene viene clonato a valle di un promotore inducibile pGAL1).
Siccome i pathway delle MAPK sono coinvolti nella risposta a stress ho verificato cosa accade in diverse condizioni di stress. Ho potuto constatare che, nel caso di quello salino, le cellule che esprimono BRAFV600E crescono meglio rispetto a quelle trasformate con il plasmide vuoto pYES2. Questo vantaggio di crescita suggerisce che probabilmente la presenza di BRAFV600E interferisce con il pathway delle MAPK del lievito.
Una volta accertata l’espressione di BRAFV600E nel ceppo di lievito e dimostrato un suo effetto nel pathway delle MAPK, ho proseguito il lavoro andando ad effettuare uno screening genetico per identificare proteine che interagiscono funzionalmente con BRAFV600E.
Per fare questo ho trasformato il plasmide contenente BRAFV600E nell’yeast deletion pool. Ho quindi piastrato i ceppi trasformati in un terreno selettivo privo di uracile, per identificare i cloni che hanno il plasmide, per poi replicarli in un terreno sempre selettivo ma contenente galattosio così da indurre l’espressione del gene BRAFV600E.
I cloni che hanno difficoltà di crescita in presenza di BRAFV600E sono quei cloni la cui funzione genica mancante rappresenta un interattore funzionale di BRAFV600E.
Dopo aver trasformato l’intera library 8 volte, ho individuato 50 cloni di cui ho sequenziato il genoma, per identificare la funzione genica mancante.
Al netto dei cloni doppi, ho così ottenuto che: 5 geni deleti sono ORF coinvolte nel metabolismo del galattosio, la cui delezione motiva l’assenza di crescita nel terreno selettivo SC-URA+Gal; 6 hanno l’ortologo nell’uomo; gli altri 16 sono deleti per geni che, benché non abbiano l’ortologo umano, possono essere coinvolti in pathway che vanno ad interagire direttamente o indirettamente con BRAFV600E.
I 6 cloni con ortologhi umani deleti sono stati ulteriormente caratterizzati mediante western blot e spot assay per valutare l’effettiva alterazione della crescita. Inoltre ho trasformato i 6 ceppi con delezione in geni che hanno un ortologo umano, utilizzando i vettori per l’espressione di BRAFwt e BRAFV600E∆3-10 per vedere se anche queste forme di BRAF rallentano la crescita come BRAFV600E. Il risultato ottenuto indica che queste forme di BRAF non influenzano la crescita e che quindi il fenotipo osservato, dei ceppi deleti che abbiamo ottenuto, è specifico per BRAFV600E.
Gli scenari di possibili indagini che si aprono grazie a questi risultati sono assai vasti: per ciascun gene trovato che ha l’omologo nell’uomo possiamo infatti disegnare dei primer per andare così a verificare il loro livello di espressione in diverse linee di melanoma.
Per ampliare il numero di geni da investigare ripeteremo lo screening, andando però a trasformare l’YDP con i plasmidi contenti il BRAF wt e la forma di BRAF responsabile della resistenza al farmaco Vemurafenib. Potremo successivamente riproporre esperimenti di cross expression per i differenti cloni individuati nei vari screening, andando così a stilare una lista di nuovi interattori, isoforma-specifici e non, potenzialmente utilizzabili nella terapia del melanoma.
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