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• purificazione
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• denaturazione termica
• dicroismo circolare
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• cromatografia

L’obiettivo principale del mio lavoro di tesi è stato di sviluppare e ottimizzare un protocollo di purificazione di due varianti di una proteina artificiale realizzata de novo, denominata Octarellin V, con l’obiettivo secondario di andare a caratterizzarle biofisicamente e rendere possibile un confronto con la originale in termini di stabilità e composizione della struttura secondaria. Il progetto Octarellin nasce negli anni ’90 nei laboratori di chimica dell’Università di Liegi in Belgio, con l’idea di sviluppare delle metodologie di de novo protein design per cercare sequenze compatibili con un ripiegamento predeterminato e con la finalità a lungo termine di realizzare nuove molecole proteiche che si ripiegano a una struttura proteica target di dimensioni sempre più grandi. Nell’attuale stato dell’arte ci sono diversi esempi di proteine ed enzimi con funzione catalitica artificiali di grandi dimensioni, a dominio singolo o multiplo. É stato impossibile, fino a poco tempo fa, produrre una proteina artificiale a singolo dominio ben strutturata con più di 200 aminoacidi, un traguardo ideale che è stato oltrepassato con la produzione di Octarellin V. Essa è organizzata in una struttura barile TIM formato da otto subunità alpha elica-foglietto beta ripetuti che costituisce uno dei motivi strutturali più comuni in natura tra gli enzimi. É la quinta generazione di questo genere di proteine artificiali, progettata de novo al computer tramite software specifici e in seguito prodotta per tecnologia ricombinante in organismi batterici competenti trasformati col vettore che porta la sequenza codificante col fine di andare a verificare l’effettiva corrispondenza strutturale con il modello in silico. Octarellin V.I risulta essere un miglioramento della versione precende la cui sequenza è stata modificata per Direct Evolution portando a un incremento di stabilità e solubilità rispetto al precedente costrutto, rendendo possibile l’analisi della struttura secondaria e terziaria. Il mio lavoro è stato incentrato sulla produzione e studio di due varianti, Octarellin V 4P e Octarellin V.I Δ4P, che differiscono per alcuni aminoacidi dalla sequenza originale. Data la bassa solubilità di queste e la mancanza di protocolli standardizzati si sono presentate alcune problematiche nel processo di purificazione riguardanti persistenti contaminazioni e l’alta tendenza ad aggregare. Dopo alcuni tentativi e apportando le giuste modifiche al protocollo le proteine sono state isolate e sottoposte ad analisi biofisiche per determinarne la struttura secondaria e per testarne la stabilità alla denaturazione termica. Questi esperimenti sono stati utili nel fornire dati non solo su struttura e proprietà della proteina prodotta ma anche sull’efficienza effettiva del protocollo di purificazione messo a punto.