• SSH
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• memoria
• apprendimento

Durante il mio internato di tesi sono stata inserita in attività di ricerca relativa a studi sui meccanismi dell’apprendimento e della memoria a lungo termine. Ho avuto così la possibilità di applicare tecniche di biologia molecolare per analizzare le modificazioni dell’espressione genica durante fenomeni di plasticità legati alla memoria ,nel sistema nervoso centrale del ratto.
Il lavoro sperimentale è stato suddiviso in due parti:
Nella prima parte del lavoro sono stati studiati i meccanismi molecolari alla base della memoria indotta dall’apprendimento contestuale alla paura o contextual fear conditional (CFC). Ratti sottoposti a questo addestramento mostrano freezing tutte le volte che sono reinseriti nell’apparato di condizionamento a partire da 0 fino a 28 giorni dopo il CFC. Inoltre in slices di ippocampo ottenute da animali sottoposti a CFC si registra un aumento dell’eccitabilità sinaptica, a partire da 0 fino a 7 giorni dall’addestramento. Tali modificazioni comportamentali ed elettrofisiologiche permanenti nel tempo suggeriscono una possibile modificazione dell’espressione genica e della sintesi di proteine. Per individuare i geni la cui espressione risulta modulata in seguito al CFC è stata utilizzata la tecnica dell’ibridazione sottrattivi soppressiva (Suppression subtractive hybridisation), tecnica che, tramite la costruzione di librerie sottrative di cDNA, permette l’isolamento delle sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame. In particolare, l’efficenza della SSH consiste nella capacità di isolare tutti i possibili trascritti, anche quelli più rari, non evidenziabili con altre tecniche che analizzano “pattern” di espressione genica. Questa tecnica ha permesso di comparare, 48 ore dopo il condizionamento, i trascritti isolati dalle regioni medio-temporali del cervello di ratti sottoposti a CFC rispetto a quelli isolati dai ratti di controllo mai entrati nell’apparato di condizionamento. Le librerie ottenute sono state clonate e sottoposte a screening. I cloni candidati ad essere differenzialmente espressi, sono state sequenziati e le sequenze ottenute sono state comparate con quelle depositate in GenBank, utilizzando software come FASTA e BLAST. In base alla funzione fisiologica svolta dalle proteine tradotte, i cloni sono stati divisi nelle seguenti categorie funzionali: metabolismo energetico, formazione e rilascio di vescicole, turn-over proteico e cascate di traduzione del segnale. L’analisi di espressione dei geni isolati è stata eseguita tramite real-time PCR.
Nella seconda parte del lavoro sono state valutate le variazioni a carico di geni differenzialmente espressi in seguito a trattamento cronico Acetil-L-Carnitina (ALC), molecola coinvolta nei processi di apprendimento. Tali variazioni sono state riscontrate anche a livello delle proteine sintetizzate a partire dal RNAmessaggero. I geni sono stati individuati grazie all’utilizzo della dell’ibridazione sottrattiva soppressiva SSH. I geni analizzati codificano per le seguenti proteine: la proteina basica della mielina, la catena leggera della chinesina e pompa H  -ATPasica lisosomiale subunità D del settore V1. Tali proteine sono coinvolte nei processi neuroprotettivi e neurodegenerativi del sistema nervoso. Per valutare l’espressione delle proteine abbiamo utilizzato il western blotting, procedura che combina la risoluzione di un gel elettroforetico con la specificità di riconoscimento di un anticorpo.