• cfDNA
• carcinoma polmonare
• acidi nucleici circolanti
• cfRNA

Il tumore del polmone è la prima causa di morte per neoplasia nei paesi industrializzati.
La caratterizzazione delle alterazioni molecolari del tumore è essenziale per identificare i pazienti che possono beneficiare di una specifica terapia a bersaglio molecolare. In particolare i soggetti con adenocarcinoma polmonare e con mutazioni attivanti a carico del gene EGFR o con riarrangiamenti del gene ALK possono essere trattati con specifici inibitori delle tirosin chinasi. Il tessuto tumorale (biopsia solida) è considerato il materiale d’elezione per l’analisi molecolare, tuttavia per circa il 20% dei pazienti affetti da adenocarcinoma questo tipo di materiale non è disponibile. A tal proposito diversi studi hanno confermato l’utilità degli acidi nucleici liberi circolanti (cfDNA e cfRNA) per l’analisi dei marcatori predittivi e recentemente l’EMA (Agenzia Europea del Farmaco) ha approvato l’utilizzo del cfDNA per la genotipizzazione di EGFR quando non è possibile effettuare prelievi di tessuti o cellule tumorali.
Il mio progetto di tesi fa parte di un ampio studio prospettico volto a verificare la possibilità di analizzare su cfDNA e cfRNA i marcatori predittivi di risposta clinicamente rilevanti per il tumore al polmone, come EGFR, KRAS ed ALK. In questo studio sono stati arruolati 109 pazienti con sospetto clinico di tumore al polmone, per i quali sono stati raccolti 7 ml di plasma (biopsia liquida). Nei 35 pazienti con diagnosi cito-istologica positiva per adenocarcinoma polmonare è stata effettuata su cfDNA l’analisi molecolare di EGFR e KRAS, sia con saggi di Real Time PCR che mediante un pannello multi-target basato sulla tecnica Sequenom (MALDI-TOF). Per 12 dei 35 pazienti è stata valutata l’espressione aberrante di ALK su cfRNA usando uno specifico kit di Real-Time PCR. Per 23 dei 35 pazienti è stato possibile confrontare il risultato dell’analisi su biopsia liquida con quello su biopsia solida. L’analisi su cfDNA ha rilevato la presenza di mutazioni di EGFR in 3 pazienti e di mutazioni di KRAS in 4 pazienti, l’analisi su biopsia solida rispettivamente in 7 e 8 pazienti. I risultati ottenuti su biopsia liquida con Real-Time PCR e con Sequenom sono stati sempre concordanti ad eccezione di 2 casi in cui la scelta della metodica più sensibile (Real-Time PCR) è stata essenziale per una corretta genotipizzazione. Un risultato interessante riguarda un paziente per il quale la biopsia liquida costituiva l’unico materiale disponibile per la caratterizzazione molecolare: l’individuazione di una mutazione attivante a carico di EGFR su cfDNA ha reso possibile il trattamento con lo specifico farmaco a bersaglio molecolare. L’espressione aberrante di ALK è stata rilevata in due casi, per i quali l’analisi FISH su tessuto tumorale ha evidenziato la presenza del riarrangiamento genico.
Con questo studio abbiamo delineato un protocollo d’analisi dei marcatori predittivi su cfDNA applicabile a tutti i casi in cui la biopsia solida non è disponibile, dimostrando la possibilità di estendere l’analisi anche all’espressione di ALK su cfRNA. La Real-Time PCR, grazie alla sua elevata sensibilità, è la tecnica migliore per l’analisi su cfDNA, tuttavia per la maggior parte dei casi si è rivelata idonea anche la metodica Sequenom, che consente l’analisi contemporanea di più marcatori, oltre EGFR e KRAS, a partire da quantità ridotte di DNA. Nonostante il tessuto tumorale resti quello d’elezione per la caratterizzazione molecolare dei tumori, i dati ottenuti supportano l’utilità clinica della biopsia liquida sia a scopo predittivo che di monitoraggio di malattia. L’analisi di un maggior numero di casi sarà indispensabile per valutare meglio la concordanza dei risultati da tessuto tumorale e da biopsia liquida e per determinare sensibilità e specificità delle tecniche utilizzate.