• ION TORRENT
• MSH6
• RAD51
• RAD50
• TUMORE EREDITARIO DELLA MAMMELLA E DELL'OVAIO
• MRE11A

Il tumore della mammella è la neoplasia più comune nelle donne nei Paesi occidentali. Una parte dei casi ereditari sono dovuti a mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2.
BRCA1 è un gene oncosoppressore codificante per una fosfo proteina nucleare coinvolta in molti processi cellulari, quali il controllo del ciclo cellulare, la riparazione del DNA e la ricombinazione omologa.
Molte delle mutazioni in BRCA1 portano alla produzione di una proteina tronca e non funzionale altre, invece, definite VUS (Variants of Unknown Significance) sono varianti di cui non è noto il significato patologico: in genere sono sostituzioni di singolo nucleotide sia all’interno della sequenza codificante (missenso o sinonime) che nei siti di splicing .
BRCA1 interagisce con numerose proteine coinvolte nella riparazione del DNA tra le quali MSH6, MRE11A, RAD50, RAD51.
Lo studio all’interno del quale si inserisce questo progetto di tesi ha lo scopo di determinare quali tra i partner del gene BRCA1, coinvolti nei processi di ricombinazione omologa, non omologa e mismatch repair, possono contribuire all’insorgenza e alla progressione del tumore della mammella. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un ottimo sistema modello per la determinazione del ruolo dei pathways di riparazione del DNA nell’instabilità genomica indotta da BRCA1 poiché, anche se non possiede il gene omologo di BRCA1, conserva gli stessi pathways di riparazione presenti nell’uomo. In esperimenti precedenti sono stati valutati gli effetti di BRCA1wt e di alcune VUS sulla ricombinazione omologa e mutazione genica nel ceppo aploide RSY6 di S.cerevisiae. Il saggio di ricombinazione è stato condotto su ceppi deleti per specifici geni coinvolti nella riparazione del DNA. Questi ceppi sono stati trasformati con BRCA1 wt o con le VUS ed è stato valutato il loro effetto sulla ricombinazione omologa e mutazione genica. I risultati di tali saggi hanno evidenziato che l’espressione di BRCA1 wt o delle VUS nei ceppi deleti per msh6, mre11, rad50 e rad51 modifica la frequenza di ricombinazione omologa e mutazione genica. Questi dati suggeriscono che questi geni potrebbero avere un ruolo nell’instabilità genomica indotta da BRCA1.
Sulla base di questi risultati, lo scopo di questa tesi è valutare lo stato mutazionale dei geni MSH6- MRE11A- RAD50 e RAD51 nei tessuti tumorali di pazienti affetti da HBOC e carrier di VUS di BRCA1. L’ipotesi è che mutazioni in questi geni possano contribuire alla cancerogenesi mediata da BRCA1.
Per questo studio sono stati selezionati 13 tumori mammari da 13 pazienti portatori di VUS nel gene BRCA1.
L’analisi mutazionale è stata condotta utilizzando una piattaforma di Next Generation Sequencing (NGS): PGM ION TORRENT. Grazie all’utilizzo del software Ampliseq Designer è stato disegnato un pannello di primer per analizzare le regioni codificanti e le giunzioni introne-esone dei quattro geni in esame; la risultante regione target coperta è di 12,07kb.
Dovendo individuare mutazioni somatiche che, nei campioni tumorali possono essere presenti ad una frequenza molto variabile a causa dell’eterogeneità tumorale, è stata richiesta una copertura media di sequenziamento di 1000-1500X.
I dati ottenuti sono stati analizzati attraverso il software ION REPORTER. Le varianti ottenute sono state filtrate per SNP con MAF (Minor Allele Frequency) ≥ 2 % e per le delezioni nucleotidiche con MAF ≥ 5%. Per i quattro geni esaminati sono state individuate 32 varianti:10 esoniche e 22 introniche.
Dall’analisi è emerso che il gene MSH6 sembrerebbe avere un ruolo importante nella carcinogenesi mammaria,perlomeno nelle forme familiari correlate al gene BRCA1. Non altrettanto chiaro è il ruolo di RAD50. Per quanto riguarda i geni MRE11A e RAD51 non sono emersi risultati significativi, tuttavia il loro coinvolgimento con la neoplasia mammaria non può essere del tutto escluso a causa dello scarso numero di campioni analizzati.
In futuro verrà ampliata la casistica estendendo l’analisi a soggetti portatori di mutazioni deleterie di BRCA1 e a soggetti wild-type per BRCA1.