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La visualizzazione dei risultati dei gel di poliacrilammide dopo elettroforesi riveste un ruolo importante nell’analisi proteomica. Difatti dopo avere separato le proteine occorre evidenziarne bene gli spot per poter fare delle analisi qualitativamente e quantitativamente corrette.
le caratteristiche che il colorante ideale dovrebbe avere sono:
alta sensibilità, ampio range di quantificazione, omogeneità nei risultati, compatibilità con la spettrometria di massa, basso costo e bassa tossicità.
Il primo colorante utilizzato è l’argento: tra le caratteristiche dell’argento troviamo l’ottima sensibilità, nell’ordine dei ng, inoltre, ha un basso costo e non necessita di programmi software o di altri strumenti costosi per la lettura delle immagini(10). ma ha il limite della omogeneità dei risultati nonché l’interferenza con la spettrometria di massa.
Dopo l’argento, il colorante più utilizzato è il Coomassie Blue, un composto organico, che presenta buona omogeneità ed è compatibile con la spettrometria di massa ma ha una sensibilità di circa 5-10 volte l’argento(30-50ng), e ciò rappresenta un grosso limite all’utilizzo di questo colorante, perché richiede di caricare una quantità grande di proteine, col rischio di perdere parte del materiale proteico per precipitazione. Dall’altra parte, quantità di proteine troppo basse presentono il rischio che all’analisi dei gel dopo colorazione, possono sfuggire le proteine che sono maggiormente meno concentrate.
Visti i limiti dell’argento e del coomassie Blue, è nata l’esigenza di trovare un colorante che potesse accorpare la buona sensibilità dell’argento all’omogeneità ed alla compatibilità con la spettrometria di massa del Coomassie Blue.
La fluorescenza ha acquistato sempre più importanza nell’analisi proteomica. Le prime sostanze fluoroscenti, come la fluorescamine, utilizzate nella proteomica reagivano con un meccanismo attraverso un legame covalente e ciò dava dei problemi nell’analisi dei risultati.
Dopo queste molecole si sono scoperti i chelati del rutenio: molecole fluorescenti che si legano alle proteine con legame non covalente e se eccitati nell’UV o nel visibile mostrano l’immagine del loro legame. I chelati del rutenio hanno una buona sensibilità (1-5 ng), seppure inferiore all’argento, una buona omogeneità nei risultati e ottima compatibilità con la spettrometria di massa.
Il primo prodotto commerciale al rutenio utilizzato è il Sypro Ruby: esso presenta una facilità di applicazione ma ha un rapporto costo-efficacia altissimo.
Il complesso RuBP è formato da Rutenio II con tre molecole di bathophenantroline disulfonato, è un prodotto di sintesi che si può preparare in laboratorio in più modi.
Il RuBP ha le stesse caratteristiche del Sypro Ruby ma a differenza di quest’ultimo ha un rapporto costo-efficacia molto basso.
In questa tesi abbiamo messo a confronto i diversi coloranti al rutenio e confronto con l'argento in diversi campioni biologici.