• caratterizzazione tecnologica
• biodiversità
• batteri lattici
• antibiotico-resistenza
• Multilocus Sequence Typing

Il presente lavoro ha riguardato 54 ceppi di batteri lattici isolati da pecorini tradizionali toscani, prodotti a latte crudo, senza l’impiego di colture starter commerciali. I ceppi in esame erano suddivisi in 28 isolati appartenenti al genere Lactobacillus e 26 isolati appartenenti al genere Lactococcus. Nello specifico i ceppi appartenevano alle seguenti specie: Lc. lactis subsp. lactis (n=16), Lc. lactis subsp. cremoris (n=8), Lc. raffinolactis (n=2), Lb. paracasei (n=12) e Lb. plantarum (n=16). I ceppi ATCC334, ATCC20174 e ATCC19435 sono stati utilizzati come ceppi di referenza. Lo scopo della tesi è stato quello di caratterizzare, nella maniera il più completa possibile, tali microrganismi in modo da poterli utilizzare per la realizzazione di prodotti lattiero-caseari tradizionali.
I ceppi selezionati sono stati dapprima sottoposti a valutazione del profilo di antibiotico-resistenza mediante metodiche fenotipiche (diffusione su agar e microdiluizioni). Gli antibiotici presi in considerazione sono stati: ampicillina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, streptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloramfenicolo. I ceppi resistenti sono stati sottoposti a PCR per la ricerca dei geni codificanti antibiotico-resistenza. Gli isolati sono stati successivamente sottoposti a caratterizzazione tecnologica (valutazione dell’attività acidificante, valutazione dell’attività proteolitica, resistenza a cloruro di sodio, resistenza al calore) e valutazione del profilo metabolico mediante sistemi miniaturizzati API. Infine, alcuni ceppi sono stati selezionati per un’indagine relativa alla biodiversità genotipica attraverso la metodica del Multilocus Sequence Typing (MLST).
In accordo con la recente bibliografia, il presente studio ha messo in evidenza che il fenomeno di antibiotico-resistenza risulta essere globalmente contenuto nell’ambito delle flore lattiche. Le maggiori percentuali di resistenza fenotipica sono state riscontrate per il genere Lactobacillus nei confronti di cloramfenicolo (66,66%), tetraciclina (46,66%), streptomicina (23,07%) e kanamicina (6,6%). Per quanto riguarda Lactococcus una bassa percentuale di ceppi resistenti è stata invece riscontrata per tetraciclina (11,11%). E’ stato possibile osservare un fenotipo resistente accompagnato da un riscontro positivo anche per la presenza di geni codificanti la resistenza nel 5,5% della popolazione studiata e relativamente a tetraciclina (3 Lc. lactis subsp. cremoris positivi per il gene tet(M)). Per quanto riguarda Lactobacillus spp è stata evidenziata una discrepanza tra i risultati ottenuti tramite metodo di Kirby-Bauer e metodo delle microdiluizioni, probabilmente attribuibile alla mancanza di corretti parametri per l’interpretazione dei risultati ottenuti mediante metodo di Kirby-Bauer e alla mancanza di valori di cut off uniformati per i due metodi fenotipici utilizzati. Le attività acidificanti e proteolitiche hanno presentato trend simili nell’ambito delle specie considerate: Lb. paracasei e Lc. lactis subsp. lactis hanno mostrato attività maggiori, mentre Lb. plantarum e Lc. lactis subsp. cremoris si sono mostrate globalmente meno acidificanti e meno proteolitiche, seppur con alcune eccezioni. Per quanto riguarda la resistenza a temperatura, tutti i ceppi sono stati in grado di tollerare 40°C e 43°C, solamente 2 Lc. lactis subsp.cremoris e 1 Lb. parcacasei tolleravano 45°C. Relativamente alla resistenza al sale tutti lattobacilli tolleravano 4,5% e 6% NaCl, mentre solo 8 ceppi erano in grado di sviluppare in presenza del 6,5% di NaCl. I lattococchi sono risultati essere invece sensibili già al 4,5% di NaCl, solo 8 ceppi sono stati infatti in grado di crescere, seppur debolmente al 6% NaCl. Sono stati, inoltre, osservati diversi profili API: per quanto riguarda Lb. plantarum tra i 16 ceppi studiati sono stati evidenziati 5 profili diversi; per i 12 ceppi Lb. paracasei sono stati osservati 7 profili; per i 16 ceppi di Lc. lactis subsp lactis 7 profili; per gli 8 ceppi di Lc. lactis subsp cremoris 5 profili ed infine i due ceppi di Lc. raffinolactis presentavano 2 diversi profili biochimici. L’analisi attraverso MLST ha rappresentato un valido strumento per raggiungere un’identificazione a livello di ceppo. Sono stati osservati ceppi con fenotipo diverso, ma al contempo dotati di uno stesso profilo ST. Al contrario ceppi che avevano caratteristiche metaboliche e tecnologiche sovrapponibili hanno presentato poi un genotipo diverso. La maggiore biodiversità genotipica è stata osservata tra i ceppi appartenenti alla specie Lb. paracasei (9 ceppi, 7 profili ST), mentre per Lc. lactis è stata osservata una minore variabilità (18 ceppi, 10 profili ST). Questa metodica consente quindi di poter eliminare eventuali ridondanze a livello di ceppoteca e poter offrire ai produttori dei ceppi diversi da utilizzare in programmi di rotazione in caseificio, anche in previsione di un’eventuale infezione fagica.