• vettori lentivirali
• isolatore cromatinico sns5
• tecnica 3C

La correzione genetica di cellule staminali ematopoietiche, mediante terapia genica con vettori lentivirali ricombinanti, ha recentemente condotto a risultati positivi per la cura di due gravi patologie come la adrenoleucodistrofia e la β-talassemia.
I vettori lentivirali eliminano alcuni degli aspetti negativi legati all’uso dei vettori onco-retrovirali, ma integrandosi in maniera abbastanza casuale nel genoma della cellula ospite sono soggetti a “effetti posizione” che si manifestano come silenziamento (PE), come variegazione all’interno della progenie cellulare (PEV) e come estinguimento. Questi effetti limitano l’efficacia dei vettori e possono influenzare l’espressione di geni adiacenti al sito di integrazione, dando origine a problemi di oncogenesi inserzionale.
Una possibile soluzione per rendere più efficaci e più sicuri i vettori di terapia genica prevede l’inclusione nei vettori di isolatori cromatinici, elementi di DNA che delimitano unità funzionali.
La possibilità di contrastare gli effetti posizione determinerebbe una terapia più sicura, potendo ottenere l’effetto terapeutico desiderato in cellule geneticamente modificate con il minor numero di vettori.
Scopo di questa tesi è studiare l’effetto dell’isolatore cromatinico di riccio di mare sns5 sull’espressione del vettore lentivirale TNS9.3, ricombinante per il gene della β-globina umana e candidato per un trial clinico di terapia genica per la cura della β-talassemia negli Stati Uniti.
I vettori TNS9.3 e TNS9.3+sns5 (contente l’isolatore in posizione fiancheggiante il transgene in entrambe le LTR virali), sono stati transinfettati in cellule eritroleucemiche di topo (MEL) con una molteplicità d’infezione (MOI) molto bassa (2/5), allo scopo di ottenere cloni cellulari contenenti una singola copia di vettore per cellula. Cloni individuali, ottenuti tramite limiting dilution, sono stati analizzati per la presenza del provirus mediante PCR e per il numero di copie di vettore mediante Q-PCR.
Cloni a singola copia di vettore sono stati ulteriormente espansi per l’analisi d’espressione del transgene β-globinico, dopo induzione a differenziamento eritroide terminale in presenza di HMBA (esametilbisacetamide) per 4 giorni.
I risultati di questa analisi indicano che la presenza di sns5 impartisce una maggiore probabilità di espressione al vettore TNS9.3, in quanto il 94% dei cloni PCR positivi esprime il gene globinico umano, contro il 45% dei cloni contenente il vettore non isolato. Inoltre, i livelli d’espressione del gene β-globinico umano isolato risultano 2,3 volte maggiori rispetto a quelli del vettore non isolato.
Questo potrebbe derivare da un minor grado di variegazione dell’espressione del vettore tra cellule dello stesso clone o da un’azione di enhancer esercitata dallo stesso sns5. Per potere distinguere fra queste due possibilità è stato analizzato l’effetto di sns5 in vettori lentivirali contenenti il gene marcatore GFP sotto il controllo del promotore PGK (LV-GFP).
I vettori LV-GFP e LV-GFP+sns5 sono stati transinfettati, a MOI bassi, in cellule MEL e più di 200 cloni cellulari per ogni costruzione sono stati analizzati per rilevare la presenza del vettore (mediante PCR) e l’espressione di GFP (mediante citofluorimetria). La percentuale dei cloni che esprimevano il transgene (GFP+/PCR+) è stata maggiore per il vettore isolato (89%) rispetto al non-isolato (42%).
L’analisi citofluorimetrica ha rilevato una percentuale di cloni variegati (cloni con una percentuale di cellule GFP+ inferiore al 100%) minore per il vettore isolato (7,4%) rispetto al vettore non isolato (13,9%).
L’espressione di una copia di transgene isolato non è variata significativamente tra cloni isolati e non, come rilevato dai valori dell’intensità media di fluorescenza (MFI). Questi risultati confermano l’azione di elemento di confine di sns5, che si manifesta sia nell’aumento della probabilità d’espressione sia nella diminuzione della variegazione intraclonale; inoltre i valori di MFI escludono che sns5 possieda un’azione di enhancer. Uno dei modelli proposti in letteratura per spiegare in che modo gli isolatori delimitano domini funzionali diversi, ipotizza la formazione di un’ansa cromatinica che si crea per interazione mediata dai complessi proteici assemblati su due copie di isolatori. La cromatina fissata di cloni contenenti una copia di vettore LV-GFP, rispettivamente isolato e non-isolato, è stata analizzata mediante la tecnologia 3C (Chromosome Conformation Capture), utilizzando enzimi di restrizione che tagliano all’interno dell’unità trascrizionale compresa tra le due copie di sns5. In seguito incubazione dei prodotti di restrizione con DNA ligasi (in condizioni di diluizione spinta, per favorire ligasi intramolecolare), la miscela di reazione è stata sottoposta a PCR con primers specifici. Questa analisi ha evidenziato, nel solo campione di cromatina contenente LV-GFP+sns5, un amplicone di dimensioni corrispondenti alla sequenza ibrida che si otterrebbe in presenza di un’ansa cromatinica prefissata.