• risposta
• regolazione
• desensitizzazione
• GRK2
• GPR17
• ERK
• OPC

Il GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) strutturalmente e filogeneticamente correlato ai recettori purinergici (P2Y) e ai recettori leucotrienici (CysLT). Questo GPCR, accoppiato principalmente a proteine Gi e, in misura minore a proteine Gq, è un recettore dualistico, che risponde a due classi chimiche distinte di ligandi endogeni: i cisteinil-leucotrieni (LTD4, LTC4, LTE4) e i nucleotidi uridinici (UDP, UDP-glucosio), con una affinità nell’ordine del nanomolare e micromolare, rispettivamente.
In condizioni fisiologiche, il GPR17 è normalmente espresso a livello del sistema nervoso centrale in neuroni e in un sottoinsieme di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC).
In condizioni patologiche, quali ischemia cerebrale e lesioni al midollo spinale, sono stati osservati profondi cambiamenti nel profilo di espressione spazio-temporale di questo recettore a partire dal sito di lesione: il GPR17 si presenta, infatti, come un “sensore” attivato dal danno, inducendo, in una prima fase, morte cellulare nel core della lesione, e promuovendo, in tempi successivi, processi di rimodellamento, ricostruzione e ripresa della funzione tissutale.
Studi recenti dimostrano che l'espressione del GPR17 va incontro a una up-regulation durante il differenziamento degli OPC a pre-oligodendrociti, e successivamente, incontro a down-regulation durante il processo di transizione a cellule mature, producenti mielina; a stadi intermedi di differenziamento sembra essere necessaria una drastica diminuzione dell’espressione del recettore GPR17 affinché le cellule portino a completamento il processo di maturazione. Sulla base di questi dati è stato presupposto che, affinchè si completi la maturazione dei pre-oligodendrociti, questo GPCR debba andare incontro a fenomeni di desensitizzazione (ovvero perdita della funzionalità in seguito a stimolazione prolungata del recettore), internalizzazione e down-regulation. In cellule di astrocitoma (1321N1) trasfettate con il GPR17 umano (hGPR17), è stato inoltre dimostrato che, dopo stimolazione con agonisti purinergici e leucotrienici, il recettore va incontro a desensitizzazione e internalizzazione in maniera tempo e concentrazione dipendente.
Le due classi di agonisti per il recettore GPR17 sono in grado di influenzare vicendevolmente le risposte di stimolazione del recettore, anche se in maniera diversa. In particolare, la stimolazione del sito purinergico è in grado di potenziare le risposte di attivazione e di indurre desensitizzazione del sito leucotrienico. Al contrario, la stimolazione del sito leucotrienico potenzia le risposte di attivazione del sito purinergico solo a concentrazioni sub-massimali, e non è in grado di indurre desensitizzazione di tale sito.
La desensitizzazione di un GPCR implica, in genere, la fosforilazione del recettore su residui amminoacidici conservati, come serina e treonina, ad opera di chinasi specifiche, dette GRK, e la conseguente internalizzazione del complesso recettore-ligando. Questo processo comporta un aumento dell’affinità del recettore per una proteina citoplasmatica, denominata β-arrestina, che, una volta legatasi al recettore fosforilato, ne permette l’internalizzazione. Oltre alle GRK, altre chinasi, quali PKC, PKA, possono giocare un ruolo importante nei processi di desensitizzazione di un GPCR.
Su queste basi, l’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare la risposta funzionale e l’attivazione di vie intracellulari del recettore GPR17 dopo stimolazione con ligandi leucotrienici e purinergici, sia in cellule trasfettate stabilmente che in colture primarie di OPCs, esprimenti costitutivamente il recettore in esame. In particolare, in cellule 1321N1 hGPR17 abbiamo valutato: 1) il ruolo di alcune chinasi, quali GRK2 e PKC, nei fenomeni di desensitizzazione del GPR17, impiegando il saggio funzionale di misurazione dell’AMPc; 2) l’attivazione di vie intracellulari, quali le MAPK ERK1/2, dopo stimolazione del recettore. Utilizzando colture primarie gliali di ratto, abbiamo inoltre valutato: 1) tramite saggi di Real-time PCR, la variazione dell’espressione di GPR17 e della chinasi GRK2, durante il fisiologico processo di differenziamento degli OPC; 2) le cinetiche di desensitizzazione recettoriale nello stadio di differenziamento in cui si è osservato il picco di espressione del recettore GPR17.