• SSH
• ALC
• Hirudo medicinalis

Questa tesi sperimentale si inserisce in un progetto di ricerca finalizzato allo studio degli effetti della Acetil-L-Carnitina (ALC) nel sistema nervoso dell’invertebrato Hirudo medicinalis. La ALC è una biomolecola naturale alla quale è riconosciuta la capacità di influenzare molteplici aspetti del metabolismo neuronale. Studi comportamentali condotti nei nostri laboratori hanno dimostrato che la ALC influenza i processi di apprendimento non associativo quali la disabitudine e la sensitizzazione nell’induzione al nuoto della sanguisuga. In particolare è emerso che la ALC blocca la sensitizzazione e riduce la disabitudine nell’induzione al nuoto e che tali effetti si protraggono nel tempo a partire da 2 ore fino a 11 giorni dopo la singola somministrazione della sostanza. Il fatto che la ALC abbia effetti così duraturi nel tempo ha suggerito l’ipotesi di una sintesi differenziale di mRNA che possa portare alla modulazione o alla neosintesi di proteine nel sistema nervoso di Hirudo in seguito al trattamento. A tal fine abbiamo utilizzato la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (Suppression subtractive hybridisation, SSH), un efficiente metodo che, tramite la costruzione di librerie sottrative di cDNA, permette l’isolamento delle sequenze differenzialmente espresse dal trattamento in esame. In particolare, l’efficenza della SSH consiste nella capacità di isolare anche trascritti più rari, non evidenziabili con altre tecniche che analizzano “pattern” di espressione genica. In questo lavoro sperimentale un gruppo di sanguisughe è stato sottoposto ad iniezione di ALC 2 mM (gruppo sperimentale) mentre un altro gruppo è stato sottoposto ad iniezione di soluzione fisiologica (gruppo di controllo). A distanza di 11 giorni dal trattamento, sono state estratte le catene gangliari sia degli animali sperimentali che di controllo da cui poi è stato isolato l’RNA totale. Data l’esigua quantità di RNA totale estratta, per ottenere il cDNA è stato utilizzato il BD SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit (BD Biosciences, Clontech). I cDNA così ottenuti attraverso la metodica dell’ibridazione sottrattiva-soppressiva sono stati utilizzati per costruire una libreria forward e una reverse rispettivamente costituite dai trascritti indotti, disattivati o modulati in seguito alla somministrazione di ALC. Dopo aver valutato l’efficienza di sottrazione, i cDNA sono stati clonati e sottoposti a screening differenziale. I cloni ottenuti si stanno sequenziando per mezzo di un sequenziatore automatico, e si stanno analizzando le sequenze utilizzando programmi quali FASTA, BLASTX e BLASTIN. La reale espressione differenzile sarà poi analizzata mediante Virtual-Northern e PCR relativa.