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I Ribozimi hammerhead sono piccole molecole oligonucleotidiche a base di RNA che possiedono attività catalitica endoribonucleasica nei confronti di specifiche molecole di RNA bersaglio (hanno un'azione in trans, agiscono cioè su filamenti di RNA diversi da sé stesso).
Questa attività catalitica è ottenuta grazie all'appaiamento di sequenze complementari all'interno della molecola e a specifici ripiegamenti della stessa che conferiscono all'oligonucleotide una conformazione tridimensionale ottimale per l'attività catalitica in questione.
I Ribozimi hammerhead trovano applicazione all'interno della strategia di “knock-down” genico grazie alla quale è possibile inibire selettivamente l'espressione di uno specifico gene.
La strategia del knock-down genico è oggetto di studi sempre maggiori per la sua potenziale applicazione in ambito antitumorale data la capacità di colpire, e quindi inibire, in modo selettivo solo l'espressione di un determinato gene.
Questo lavoro di tesi studia l'azione di due ribozimi, denominati extended ed XL, progettati in modo da dirigere la propria attività endoribonucleasica verso una sequenza di RNA presente all'interno dell'RNA messaggero di BIRC 5. Questi ribozimi rappresentano due “evoluzioni” di un primo ribozima denominato minimal, oggetto di precedenti studi e mostrano una maggiore attività catalitica proprio grazie alle modifiche strutturali ad essi apportate.
La scelta dell' RNA messaggero di BIRC 5 come bersaglio del knock-down genico è dovuta al suo ruolo fondamentale nel processo apoptotico e alla sua esperessione in alcuni dei tumori umani più comuni e la sua bassa espressione a livello dei tessuti sani differenziati.
Durante la progettazione di un ribozima, in particolare nella fase di scelta della sequenza di RNA da utilizzare come bersaglio (circa 15 nucleotidi), vengono presi in considerazione vari fattori. Uno di questi fattori è l'unicità della sequenza bersaglio scelta, che deve essere assente nel resto del trascrittoma della specie in cui lavoriamo, nel nostro caso in quello della specie umana.
Sfruttando le banche dati di geni e trascritti a disposizione in rete abbiamo individiato una significativa omologia di una sequenza contenuta nel trascritto del gene FAS con la sequenza bersaglio.
Tale analogia nella sequenza nucleotidica permette un, seppur parziale, appaiamento dell'RNA messaggero di FAS con le sequenze fiancheggianti (stem I e stem III) del ribozima (sequenze responsabili del riconoscimento del target) ed è dunque stata presa ad oggetto di studio come possibile bersaglio supplementare del ribozima.
Sono stati condotti quindi esperimenti in vitro per arrivare a valutare l'influenza del mismatch nell'appaiamento tra FAS e ribozima sull'attività catalitica del ribozima stesso.
Queste prove sono state effettuate nell'ottica di ottimizzare la procedura di progettazione del ribozima qualora l'azione catalitica si mostri efficace anche in presenza di mismatch. In tal caso infatti è opprtuno inserire nuovi parametri di selezione delle sequenze da scegliere come bersaglio del ribozima.
Il gene FAS è di particolare interesse nel nostro studio poiché si trova coinvolto, seppur con meccanismi diversi da quelli di BIRC 5, nel processo apoptotico. A tal proposito lo studio dell'azione del ribozima sul trascritto di FAS è importante per poter prevedere un eventuale effetto off-target del ribozima a livello cellulare, fattore di grande rilevanza per un possibile utilizzo in terapia del ribozima.
Per lo svolgimento di questo lavoro di Tesi sono stati innanzi tutto sintetizzati per via chimica, mediante un sintetizzatore, i ribozimi Extended e XL e le due sequenze di RNA bersaglio cioè quelle porzioni dell'RNA messaggero di FAS e BIRC 5 contenenti le parti essenziali per la reazione di catalisi (costituite da poco più di 20 nucleotidi).
Si è proceduto successivamente alla purificazione di ciasuna sequenza oligonucleotidica per passare poi alla valutazione dell'attività catalitica dei ribozimi.
Sono stati dunque svolti studi di cinetica di ciascun ribozima rispetto a ciascun target; sono stati inoltre effettuati studi in diverse condizioni analitiche variando alcuni fattori fondamentali per la reazione di catalisi, quali ad esempio la concentrazione di Magnesio, volte ad avviccinarsi il più possibile alle condizioni esistenti a livello intracellulare, nell'ottica di test su colture cellulari e di possibili future applicazioni nella terapia antitumorale.
I ribozimi hanno mostrato un'ottima attività di taglio sull'RNA di BIRC 5 anche in condizioni di basse concentrazioni di Magnesio e ad elevati rapporti molari target/ribozima.
L'azione del ribozima sull'oligonucleotide che riproduce un tratto della sequenza dell'RNA messaggero di FAS si è dimostrata rilevante anche se inferiore a quella riscontrata sul target completamente complemetare, quello di BIRC 5; questo porta a concludere che l'effetto del mismatch non è tale da impedire l'azione catalitica del ribozima. E' dunque fondamentale tenere in considerazione durante la progettazione dei ribozimi anche le sequenze che presentano una certa percentuale di omologia con la sequnza bersaglio.
Data l'azione del ribozima sia su BIRC5 che su FAS si presenta la necessità di effettuare ulteriori studi sull'azione complessiva del ribozima nell'ambiente fisiologico e in particolare sono previsti studi a livello cellulare per valutare gli effetti del ribozima sul processo apoptotico nel suo complesso in previsione di un'applicazione in terapia.