• terapia cellulare
• vettore
• FIV
• HSV1-TK
• monitoraggio cellulare

La terapia cellulare, basata sull’introduzione di nuove cellule a livello di un tessuto, mira a contrastare malattie genetiche ed infettive, mediante il trapianto di cellule staminali o di cellule progenitrici autologhe (dal paziente) o allogeniche (da un altro donatore). Tali cellule sono di norma opportunamente modificate in modo da esprimere un gene terapeutico. Strumenti efficaci ed ampiamente utilizzati per il trasferimento genico sono i vettori derivati dai lentivirus. Questi sono virus modificati in modo tale che entrino nelle cellule bersaglio ma invece di veicolare i propri geni, introducono uno o più transgeni.
Un importante vettore lentivirale è quello derivato dal virus dell'immunodeficienza felina (FIV), virus che provoca nei gatti una malattia simile alla sindrome da immunodeficienza acquisita umana ma che non infetta l’uomo. Questo vettore presenta diversi vantaggi: innanzitutto è un vettore ad uso clinico sicuro e per questo può essere più facilmente accettato dal paziente rispetto ad un vettore HIV, inoltre non induce una risposta immunitaria verso il vettore legata ad una immunità preesistente.
In questo lavoro di tesi è stato messo a punto un sistema che permetta di trasferire efficientemente e stabilmente nelle cellule un gene esogeno e, contestualmente, di monitorarle in vivo. A questo scopo è stato usato un vettore FIV derivato da LAW34, un vettore sviluppato nei nostri laboratori e che ha mostrato un’ottima efficienza di espressione di diversi geni terapeutici e reporter, in differenti tipi cellulari ed in vivo.
Inizialmente LAW34 è stato utilizzato come substrato per il clonaggio della timidina chinasi dell’herpes simplex (HSV-TK), questo transgene permette al vettore di essere usato come strumento per il monitoraggio in vivo delle cellule trasdotte mediante elettrotomografia di positroni (PET). Il monitoraggio si renderà possibile in seguito alla somministrazione di 2'-(18F) fluoro-5-etil-1-beta-D-arabinofuranosiluracile (18F-FEAU), un analogo pirimidinico non tossico ed a breve emivita che, una volta fosforilato da HSV-TK, rimarrà all’interno delle cellule trasdotte emettendo un segnale rilevabile mediante PET.
La funzionalità del vettore ottenuto, LAW34-TK, è stata valutata in vitro mediante l'aggiunta di acyclovir (ACV) alle cellule trasfettate e trasdotte la cui morte è stata monitorata mediante colorazione con ioduro di propidio.
I risultati ottenuti in vitro hanno dimostrato che HSV-TK è funzionalmente attiva in quanto capace di indurre apoptosi nelle cellule che la esprimono. Ulteriori studi permetteranno di valutare se LAW34-TK rappresenta un candidato ideale come sistema reporter anche in vivo.