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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-05122017-110053


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
CATALDI, MATTIA
URN
etd-05122017-110053
Titolo
Interazioni tra cellule neuronali e substrati microstrutturati in modelli neuropatologici
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Relatori
relatore Dott. Cecchini, Marco
relatore Dott.ssa Tonazzini, Ilaria
correlatore Prof.ssa Raffa, Vittoria
correlatore Prof. Casini, Giovanni
Parole chiave
  • Meccanotrasduzione
  • cellule neuronali
  • substrati microstrutturati
  • modelli neuropatologici
Data inizio appello
29/05/2017
Consultabilità
Completa
Riassunto
La meccanotrasduzione è un complesso meccanismo cellulare tramite il quale la cellula è in grado di convertire stimoli meccanici esterni in segnali biochimici o elettrici intracellulari. Nel mio lavoro di tesi ho studiato la risposta dei neuroni a stimoli topografici, in condizioni fisiologiche e patologiche. Ho sviluppato ed utilizzato substrati termoplastici nanostrutturati con pattern di microgratings (GRs) fabbricati tramite la tecnica della litografia nanoimprint. Questi substrati sono in grado di fornire stimoli topografici direzionali ai neuroni tramite interazioni di contatto. Ho studiato i meccanismi di guida di contatto topografica in colture primarie di neuroni ippocampali wilde-type (WT, condizione fisiologica) e senza Ube3a (ubiquitina E3a ligasi) Ube3a m-/p+ (modello della sindrome di Angelman). Ho inoltre studiato anche neuroni con overespressione di Ube3a, un ulteriore modello patologico di autismo (15dup autism).
Ho effettuato degli esperimenti per studiare la guida topografica di assoni e dendriti sui GRs e per valutare la possibilità di rescue del deficit della guida di contatto neuronale dei neuroni Ube3a-deficient..
I neuroni ippocampali (HNs) sono stati estratti da topi WT e Ube3a-deficient appena nati e poi cresciuti su GRs con periodo di 2 µm . Dopo 24-48h i neuroni ippocampali sono stati trasfettati con un vettore di controllo codificante per la proteina rossa (RFP) o con un vettore plasmidico contenente Ube3a-RFP, tramite lipofectamina. Per gli esperimenti di rescue, i neuroni sono stati esposti a farmaci che modulano la contrattilita’ del citoscheletro, in particolare a Blebbistatina (una sostanza che riduce la contrattilita’ delle fibre di actina) e Nocodazolo (che aumenta la contrattilita’). Dopo alcuni giorni in cultura, i campioni sono stati fissati e processati tramite immunostaining per marcare selettivamente gli assoni (tramite il marker selettivo SMI-312) e i dendriti (tramite il marker MAP-2).
Tramite l’utilizzo della microscopia confocale e del software Fiji, i campioni sono stati analizzati per valutare: i. la morfologia di assoni e dendriti e ii. le differenze nella capacità di leggere la topografia del substrato tra i neuroni WT e mutanti per Ube3a con e senza i vari trattamenti.
La guida da contatto è mediata dall’attivazione delle adesioni focali (FA), per cui abbiamo studiato il meccanismo molecolare valutando l’attivazione del pathway delle FA mediante la tecnica del Western Blot.
Concludendo, nel presente lavoro è stato osservato che i neuroni senza Ube3a (modello della sindrome di Angelman) hanno dei deficit di guida assonale, deficit che non si osserva nei neuroni sovraesprimenti ube3a (15dup autism). Grazie all’utilizzo dei farmaci che agiscono sulla contrattilità cellulare è stato possibile modulare la lettura della topografia. I GRs si sono rivelati un buon test pattern per valutare questi meccanismi cellulari.
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