• retrovirus
• proteine ricombinanti
• MMTV
• tumore mammario murino
• carcinoma mammario

Il carcinoma mammario è una delle neoplasie più diffuse nel mondo e la principale causa di morte per cancro nelle donne. Nonostante si conoscano diversi fattori che possono concorrere al suo sviluppo, l’infezione virale potrebbe giocare un ruolo importante durante la patogenesi, essendo questa una patologia multistep. Già da tempo, nel topo, è stata riscontrata la presenza di un retrovirus, scoperto nel 1936 da Bittner e noto come il virus del tumore mammario murino (MMTV), in grado di infettare i linfociti e le cellule dell'epitelio mammario e di indurre la formazione di neoplasie in seguito all’attivazione di determinati oncogeni adiacenti al sito di inserimento del provirus. Tale virus è stato largamente utilizzato come modello per condurre studi sul tumore mammario; infatti, molti di questi hanno rilevato la presenza di sequenze virali simili a MMTV nel genoma di linee cellulari provenienti da biopsie tumorali mammarie umane. Il sequenziamento di tali frammenti ha evidenziato un’omologia di sequenza del 56% con un retrovirus endogeno umano HERV_K10 e del 98% con MMTV. Tutto ciò ha suggerito un’eziologia virale per una certa percentuale di tumori al seno umani, facendo pensare alla possibilità che vi fosse un retrovirus, omologo a quello murino, associato al tumore al seno nell’uomo, definito Human Mammary Tumor Virus (HMTV).
Data la necessità di validare tale ipotesi, lo scopo della presente tesi è stato quello di mettere a punto strumenti che consentano di valutare nella nostra area geografica la diffusione del virus ed, eventualmente, la presenza di proteine virali in linee cellulari primarie provenienti da carcinoma mammario. A tal fine è stata ideata una strategia di clonaggio per ottenere delle proteine ricombinanti appartenenti ad MMTV. Le sequenze geniche virali prese in considerazione sono quelle codificanti per una porzione della proteina dell’envelope gp52 e per la proteina capsidica p27. Queste sono state ottenute mediante amplificazione del genoma di un topo MMTV-positivo, utilizzando dei primer degenerati. Le sequenze sono state inizialmente clonate in un vettore di clonaggio e in seguito in un vettore d’espressione che ha permesso l’aggiunta di una coda di sei istidine (6-His) alle proteine ricombinanti per consentirne la purificazione, sfruttando una resina al nichel, e l’individuazione con anticorpi anti-6xHis tramite la metodica del Western Blot. Una volta ottenute le proteine ricombinanti parzialmente purificate, il nostro intento è stato quello di provare a produrre, a partire da quest’ultime, degli anticorpi monoclonali che potranno essere utilizzati per ricercare proteine virali MMTV-like in colture di cellule tumorali mammarie umane, sfruttando la similarità tra i due virus. Contemporaneamente, per valurare la diffusione di HMTV nella popolazione locale, partendo dalle proteine ricombinanti purificate che fungono da antigene, è stato allestito un saggio immunologico, condotto in Western Blot, in modo da effettuare un’analisi sierologica su individui sani e affetti da tumore mammario.