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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-05062018-164934


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale LM5
Autore
PULGA, FRANCESCA
URN
etd-05062018-164934
Titolo
Sintesi e valutazione funzionale di inibitori di Aldeide Deidrogenasi a nucleo imidazopiridinico
Dipartimento
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Relatori
relatore Prof.ssa La Motta, Concettina
relatore Dott. Quattrini, Luca
Parole chiave
  • cellule staminali tumorali
  • ALDH1A3
  • ALDH1A1
  • ALDH
  • Aldeide deidrogenasi
Data inizio appello
30/05/2018
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
30/05/2088
Riassunto
Durante il mio progetto di tesi mi sono occupata della progettazione e della sintesi di nuovi inibitori di aldeide deidrogenasi 1A (ALDH1A) a nucleo imidazo[1,2-a]piridinico e della loro valutazione funzionale tramite saggi in vitro di inibizione enzimatica. La parte di sintesi è stata svolta presso il Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, mentre la valutazione funzionale è stata effettuata presso il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università del Piemonte Orientale.
La famiglia delle aldeidi deidrogenasi comprende 19 isoenzimi NAD(P+) dipendenti, che svolgono importanti funzioni fisiologiche e detossificanti, metabolizzano aldeidi di derivazione endogena ed esogena, ossidandole ai rispettivi acidi carbossilici.
Nei mammiferi l’enzima può esistere sia in forma omo-dimerica che omo-tetramerica. Il sito catalitico, presente a livello di ciascun monomero, è altamente conservato e si contraddistingue per la presenza di tre residui aminoacidici chiave, Cys302, Lys192 e Glu268, che si mantengono inalterati in pressochè tutte le forme isoenzimatiche conosciute.
La sottofamiglia ALDH1A, comprendente ALDH1A1, ALDH1A2, e ALDH1A3 sintetizza acido retinoico dal retinale. Inoltre, ed in particolare ALDH1A1, contribuisce all’ossidazione dell’acetaldeide, a difendere i tessuti superficiali oculari dalle specie reattive dell’ossigeno ed è implicata nel metabolismo della dopamina.
Tuttavia, nonostante questo ruolo fisiologico, l’incremento dell’espressione e dell’attività di ALDH1 è stata riscontrata in vari tumori umani, facendo diventare questo enzima un promettente target farmacologico per lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali.[1]
Per la progettazione di nuovi inibitori il nostro studio si è basato su molecole naturali in grado di inibire selettivamente l’enzima. La daidzina, 7-O-glucosil-4’-idrossi-isoflavone, è un isoflavone estratto in natura dalla Radix puerariae che presenta attività inibitoria selettiva e reversibile nei confronti dell’enzima target.[2] Grazie allo studio struttura-attività della daidzina e dei suoi congeneri è stato evidenziato che la porzione zuccherina in posizione 7 del nucleo eterociclico e il gruppo carbonilico in posizione 4 non risultano essere farmacofori chiave per l’interazione con ALDH1. Per questo motivo, e con il fine di ottenere inibitori con un miglior profilo farmacocinetico, sono state apportate modifiche alle suddette porzioni, ottenendo il derivato 2,6-difenilimidazo[1,2-a]piridina (GA11).
Rispetto alla daidzina, GA11 risulta essere una molecola più piccola e planare, caratterizzata da un’estesa area lipofila e da una minore capacità di formare legami ad H. Saggiato in vitro sulla proteina isolata ed in vivo su modelli animali di glioblastoma, GA11 ha evidenziato sia una buona capacità di inibizione dell’enzima target che una promettente attività antitumorale, imponendosi quindi come hit compound per lo sviluppo di una nuova serie di agenti anti-tumorali ad attività inibente ALDH1A.[3] Non avendo ancora disponibile la struttura cristallizzata dell’enzima con il composto di riferimento, l’ottimizzazione di GA11 è proceduta mediante un approccio razionale, introducendo sostituenti di natura elettronica e sterica diversa sugli anelli aromatici presenti in posizione 2 e 6 sul nucleo eterociclico. Le molecole da me sintetizzate fanno parte di una più ampia libreria di composti che differiscono posizione e tipologia di sostituzione delle porzioni aromatiche inserite sul nucleo imidazopiridinico.
La libreria è stata da me saggiata presso il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università del Piemonte Orientale in un saggio di inibizione enzimatica in vitro condotto sulle isoforme ALDH1A1 e 1A3. Gli enzimi ALDH1A1 e 1A3 sono stati espressi e purificati da E. coli. I saggi sono stati effettuati in un volume totale di 200µL utilizzando 20mM di Tris HCl, pH 8.0, 1M β-mercaptoetanolo, 150nM KCl e 2,6µM di enzima ricombinante puro. L’attività enzimatica in presenza degli inibitori, disciolti in DMSO, è stata monitorata misurando la formazione di NADH a 340nm per 30 minuti a 25°C.[4] I risultati ottenuti ci hanno permesso di effettuare un’analisi preliminare dei rapporti struttura attività dei derivati imidazopiridinici sintetizzati, evidenziando la possibilità di sviluppare inibitori selettivi per le due diverse isoforme enzimatiche.

fanno parte di una più ampia libreria di composti che differiscono posizione e tipologia di sostituzione delle porzioni aromatiche inserite sul nucleo imidazopiridinico.
La libreria è stata da me saggiata presso il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università del Piemonte Orientale in un saggio di inibizione enzimatica in vitro condotto sulle isoforme ALDH1A1 e 1A3. Gli enzimi ALDH1A1 e 1A3 sono stati espressi e purificati da E. coli. I saggi sono stati effettuati in un volume totale di 200µL utilizzando 20mM di Tris HCl, pH 8.0, 1M β-mercaptoetanolo, 150nM KCl e 2,6µM di enzima ricombinante puro. L’attività enzimatica in presenza degli inibitori, disciolti in DMSO, è stata monitorata misurando la formazione di NADH a 340nm per 30 minuti a 25°C.[4] I risultati ottenuti ci hanno permesso di effettuare un’analisi preliminare dei rapporti struttura attività dei derivati imidazopiridinici sintetizzati, evidenziando la possibilità di sviluppare inibitori selettivi per le due diverse isoforme enzimatiche.
fanno parte di una più ampia libreria di composti che differiscono posizione e tipologia di sostituzione delle porzioni aromatiche inserite sul nucleo imidazopiridinico.
La libreria è stata da me saggiata presso il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università del Piemonte Orientale in un saggio di inibizione enzimatica in vitro condotto sulle isoforme ALDH1A1 e 1A3. Gli enzimi ALDH1A1 e 1A3 sono stati espressi e purificati da E. coli. I saggi sono stati effettuati in un volume totale di 200µL utilizzando 20mM di Tris HCl, pH 8.0, 1M β-mercaptoetanolo, 150nM KCl e 2,6µM di enzima ricombinante puro. L’attività enzimatica in presenza degli inibitori, disciolti in DMSO, è stata monitorata misurando la formazione di NADH a 340nm per 30 minuti a 25°C.[4] I risultati ottenuti ci hanno permesso di effettuare un’analisi preliminare dei rapporti struttura attività dei derivati imidazopiridinici sintetizzati, evidenziando la possibilità di sviluppare inibitori selettivi per le due diverse isoforme enzimatiche.
fanno parte di una più ampia libreria di composti che differiscono posizione e tipologia di sostituzione delle porzioni aromatiche inserite sul nucleo imidazopiridinico.
La libreria è stata da me saggiata presso il Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università del Piemonte Orientale in un saggio di inibizione enzimatica in vitro condotto sulle isoforme ALDH1A1 e 1A3. Gli enzimi ALDH1A1 e 1A3 sono stati espressi e purificati da E. coli. I saggi sono stati effettuati in un volume totale di 200µL utilizzando 20mM di Tris HCl, pH 8.0, 1M β-mercaptoetanolo, 150nM KCl e 2,6µM di enzima ricombinante puro. L’attività enzimatica in presenza degli inibitori, disciolti in DMSO, è stata monitorata misurando la formazione di NADH a 340nm per 30 minuti a 25°C.[4] I risultati ottenuti ci hanno permesso di effettuare un’analisi preliminare dei rapporti struttura attività dei derivati imidazopiridinici sintetizzati, evidenziando la possibilità di sviluppare inibitori selettivi per le due diverse isoforme enzimatiche.

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