• calcium spiking
• calcium signalling
• symbiosis
• calcium sensors

Il calcio è un messaggero intracellulare responsabile del controllo di numerosi processi sia in cellule vegetali che in cellule animali e rappresenta un punto di convergenza di molti differenti pathways di segnalazione.
Tra i modelli per lo studio del calcium signalling in cellule vegetali troviamo le oscillazioni nei livelli di calcio che si verificano a livello nucleare al momento dell’instaurarsi di simbiosi micorriziche o con batteri in grado di fissare l’azoto. Tali ripetuti e repentini innalzamenti della concentrazione di calcio sono stati chiamati calcium spiking. Si ritiene che, nell’ambito delle simbiosi piante-batteri, il calcium spiking nei nuclei dei tricoblasti sia un tratto comune condiviso da tutte le specie in grado di formare noduli radicali.
Un primo approccio per lo studio delle variazioni dei livelli di calcio nel nucleo delle cellule vegetali è stato quello della microinienzione di calcium-responsive dyes. Uno dei maggiori svantaggi di questa tecnica risiede nel fatto che tali composti non sono confinati nel nucleo, ma una volta iniettati si diffondono nella cellula. Un altro metodo è quello di sfruttare particolari proteine, già esistenti in natura o di sintesi, come reporters. Il primo vantaggio in questo caso è quello di poter indirizzare la proteina nel compartimento cellulare di interesse. Possiamo distinguere due gruppi di reporters proteici di sintesi: quelli basati sulla FRET (Forster resonance energy transfer) e i cosi’ detti single wavelength calcium sensors. I Cameleons, i reporters al momento più utilizzati per lo studio del calcium spiking in cellule vegetali, fanno parte del primo gruppo. Questo comporta che essi siano disponibili in una sola variante di colore e che due diverse lunghezze d’onda debbano essere usate per lavorare con un singolo reporter. In conseguenza di ciò si ha una limitazione delle possibiltà di imaging sullo stesso campione.
In questo lavoro di tesi ci si propone di valutare la possibilità di utilizzare i GECOs (genetically encoded calcium indicators for optical imaging), un nuovo tipo di single wavelength calcium sensors, per lo studio del calcium spiking nel nucleo delle cellule dei peli radicali di M. truncatula. I GECOs, esistendo in diverse varianti di colore ed essendo costituiti da una singola proteina fluorescente, potrebbero consentire di monitorare i livelli di calcio in diversi compartimenti della stessa cellula allo stesso momento.
La costruzione dei vettori plasmidici contenenti i GECOs, che ha costituito la prima fase del lavoro, è stata portata avanti sfruttando il metodo del golden gate cloning. Tale metodo ha le caratteristiche di essere molto efficiente e di consentire l’assemblaggio di numerosi frammenti di DNA in maniera direzionale ed in una sola reazione. Grazie all’organizzazione modulare di questa tecnica di clonaggio è stato possibile costruire tutta una serie di vettori contenenti diverse combinazioni di promotori, GECOs e marker di selezione. Successivamente la correttezza dei vettori è stata verificata tramite PCR e sequenziamento. In una seconda fase si è poi proceduto alla trasformazione delle plantule di M. truncatula con alcuni dei suddetti vettori sfruttando Agrobacterium rhizogenes. L’osservazione, con la microscopia confocale, della risposta dei GECOs al calcium spiking indotto da Nod factors nelle cellule dei peli radicali di M. truncatula ha occupato la fase finale del progetto. L’analisi delle immagini e dei dati raccolti ha poi permesso di concludere che i GECOs sono una valida alternativa all’utilizzo dei Cameleons in questo campo.