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La serotonina ( 5-HT ) è un neurotrasmettitore che media una grande varietà di funzioni sia nel sistema nervoso centrale che nel sistema nervoso periferico adulto. Negli ultimi anni si è andata affermando l’idea che la serotonina, durante lo sviluppo embrionale, possa funzionare come segnale di regolazione in processi di neurogenesi, controllo della proliferazione e sinaptogenesi, aiutando a scolpire finemente l’architettura finale del sistema nervoso.
Per studiare il ruolo della serotonina durante lo sviluppo embrionale abbiamo scelto come modello sperimentale Xenopus laevis.
Come studio preliminare ho caratterizzato la presenza spazio-temporale della serotonina nel sistema nervoso di Xenopus, durante lo sviluppo, effettuando esperimenti di immunoistochimica con un anticorpo specifico contro-5HT. Questa analisi ha messo in evidenza che la serotonina è presente nei nuclei rombencefalici del raphe a partire da stadio 35 e rimane presente in queste cellule durante tutte le fasi successive dello sviluppo e nel cervello adulto. La serotonina risulta inoltre presente durante lo sviluppo in cellule amacrine dell’occhio e in cellule dell’epidermide.
Sia nella vita adulta che durante lo sviluppo le molteplici attività della serotonina sono mediate da recettori accoppiati a proteine G che hanno un’ampia distribuzione nel sistema nervoso centrale. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che l’RNA messaggero per il recettore 5-HT2B è espresso, durante lo sviluppo di Xenopus, in regioni proliferative della retina e del sistema nervoso centrale. Nel mio lavoro di tesi mi sono occupata dello studio del ruolo del recettore 5-HT2B durante lo sviluppo, effettuando esperimenti di perdita di funzione mediante la microiniezione, negli embrioni a due o quattro cellule, di un oligonucleotide antisenso modificato (morpholino) complementare alla regione a valle del primo codone dell’mRNA di X5-HT2B, ed esperimenti di guadagno di funzione mediante la microiniezione di mRNA codificante per X5-HT2B. Inoltre, per essere sicura che il recettore ectopico venisse attivato, ho somministrato 5-HT agli embrioni iniettati. Allo scopo di mettere in evidenza eventuali variazioni di struttura, proliferazione e morte cellulare legate alla modulazione di questo recettore, le sezioni di questi embrioni a stadio 42, sono state analizzate mediante: immunoistochimica con anticorpi contro N-tubulina e fosfoistone H3, ibridazione in situ per ciclina D1, tunel “assay”, colorazione hoechst.
Dall’analisi complessiva di questi esperimenti ho messo in evidenza un ruolo importante, del recettore 5-HT2B nella morfogenesi dell’occhio attraverso la regolazione della proliferazione e della sopravvivenza cellulare. Inoltre gli studi di sovraespressione genica che ho condotto confermano che gli effetti proliferativi di questo recettore sono attivati dal suo legame con la serotonina.
Parallelamente a questo studio funzionale mi sono occupata anche di caratterizzare, in Xenopus laevis, il profilo di espressione spazio-temporale di due geni implicati nell’omeostasi del sistema serotoninergico: il trasportatore serotoninergico (X5-HTT), che codifica per l’unica proteina in grado di effettuare il “re-uptake” della serotonina e la triptofano idrossilasi (XTph), enzima limitante della biosintesi della 5-HT.
Per la caratterizzazione di XTph e X5-HTT , ho costruito due sonde a RNA antisenso marcate con digossigenina, con cui ho effettuato esperimenti di ibridazioni in situ, sia su sezioni che whole mount, di embrioni di Xenopus a vari stadi, sino all’adulto. Ciò mi ha permesso di riscontrare che l’mRNA di X5-HTT è espresso nei neuroni dei nuclei del raphe a partire da stadio 30 sino all’adulto, che ha un espressione transiente intorno a stadio 33 nella ghiandola pineale e che a stadio 45 è presente nello strato nucleare interno della retina.
L’mRNA di XTph, invece, è espresso nella ghiandola pineale a partire da stadio 28, e a stadio 45 ne ho riscontrato la presenza anche nei fotorecettori della retina, nei nuclei ipotalamici ventrali, nella faringe e nell’intestino, rispecchiando il profilo di espressione dell’isoforma Tph1 nota nei mammiferi.
I risultati ottenuti durante il mio lavoro di tesi descrivono per la prima volta l’espressione del trasportatore serotoninergico durante lo sviluppo di Xenopus e confermano un ruolo importante della serotonina nella morfogenesi del sistema nervoso, ed in particolare dell’occhio, mediati dall’attivazione del recettore serotoninergico 5-HT2B. Inoltre il profilo di espressione di XTph che ho ottenuto, mi consente di ipotizzare che anche in Xenopus, come in altri vertebrati esista una seconda isoforma di Tph che sintetizza serotonina nei nuclei del raphe.