• inibitori.
• mdm2
• mdmx
• p53

Candidata: Agostina Francesca Grillone Relatori: Leonardo Rossi e Barbara Costa Correlatori: Irma Nardi e Eleonora Da pozzo

Titolo: Studio degli effetti di inibitori di MDM2 in cellule di glioblastoma e sviluppo di una nuova metodica dedicata a valutare l’attività spiazzante di potenziali inibitori della interazione p53-MDM2/X

Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore più comune e il più maligno del Sistema Nervoso Centrale ed è particolarmente resistente alle terapie attualmente in uso. Ci sono varie ragioni biologiche alla base della resistenza del GBM, ma l'inattivazione della funzione della proteina p53 è di grande importanza in questo contesto. Nel 35% dei GBM, p53 presenta sostituzioni amminoacidiche causate da mutazioni nucleotidiche nel gene che la codifica, il che determina la perdita di attività di p53. Nella maggior parte dei casi, invece, è stato osservato che i GBM possiedono p53 “wild-type” ma la sua funzione è inibita da un inappropriato aumento di attività del suo principale inibitore intracellulare, l’oncoproteina MDM2 (Murine Double Minute 2). La proteina p53, definita ‘Guardiano del genoma’ è un potente fattore di trascrizione che si attiva in risposta a sollecitazioni diverse, con conseguente induzione di arresto del ciclo cellulare, apoptosi o senescenza, legando direttamente il DNA e attivando la trascrizione di specifici geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare e dei processi vita/morte cellulari. La oncoproteina MDM2 inibisce p53 in quanto si lega al dominio di p53 coinvolto nel legame al DNA e quindi ne inibisce l’attività di trans-attivazione genica inoltre, MDM2, mediante la sua attività di ubiquitina ligasi, consente l’ esportazione di p53 dal nucleo al citoplasma e ne media la degradazione via proteosoma. Studi recenti hanno dimostrato che un'altra proteina che presenta un’alta omologia con MDM2, chiamata MDMX, riveste un ruolo importante per inibire la funzione di p53. Tali evidenze suggeriscono che l’uso di piccole molecole sintetiche in grado di ostacolare l’interazione tra p53 e i suoi inibitori naturali MDM2 e MDMX potrebbero risultare una strategia terapeutica valida per trattare il glioblastoma multiforme.
Lo scopo della presente tesi è stato di valutare la potenziale attività antitumorale in vitro di nuova piccola molecola a struttura spiro-ossindol-pirrolidinica, chiamata ISA27. In uno studio precedente effettuato dal gruppo di ricerca che ha progettato e sintetizzato questa nuova molecola è stato evidenziato che ISA27 è in grado di dissociare il complesso p53/MDM2 ricostruito in vitro mediante l’uso di proteine ricombinanti. Varie tecniche di studio della vitalità cellulare sono state applicate per valutare le capacità antiproliferative, citotossiche e pro-senescenti del composto ISA27 sulla linea cellulare di GBM umano U87MG, che esprime p53 nella sua forma “wild-type” e sovraesprime MDM2. I risultati ottenuti hanno evidenziato che ISA27 induce una riduzione della vitalità cellulare in maniera dose e tempo dipendente determinando un blocco del ciclo cellulare irreversibile e induzione di apoptosi.
Un ulteriore scopo della presente tesi è stato di sviluppare un saggio ELISA sensibile, specifico e rapido per determinare se nuove molecole sintetiche progettate come inibitori di MDM2/X, sono in grado di inibire efficacemente l’interazione tra p53 e MDM2/X.
A tale fine, è stato ideato un saggio che prevede di utilizzare piastre rivestite di glutatione alle quali legare le proteine ricombinanti MDM2-GST o MDMX-GST. Le proteine MDM2 o MDMX così immobilizzate verranno poi incubate con il peptide p53 biotinilato in presenza od in assenza di farmaci con presunta attività inibitoria su MDM2/X. La quantità di peptide legato verrà poi rivelata mediante l’utilizzo di streptavidina coniugata con l’enzima perossidasi che, in presenza del suo substrato, determina lo sviluppo di una colorazione monitorabile mediante spettrometria. Lo sviluppo di questo saggio potrebbe rappresentare uno strumento prezioso per lo screening di molecole che, sulla base di studi di molecular-modeling, sono potenziali candidati come inibitori dell’interazione p53-MDM2/X in quanto non esistono al momento saggi specifici ed economici da applicare su larga scala soprattutto per la molecola MDMX.