• cellule staminali embrionali
• calcium imaging
• patch clamp whole cell
• nucleocinesi
• nucleokinesis
• accrescimento assonale
• axonal outgrowth
• embryonic stem cells
• knockin
• eGFP
• 5-HT neurons
• differenziamento serotoninergico in vitro
• in vitro serotonergic differentiation
• time lapse microscopy

I neuroni serotoninergici sono localizzati nei nuclei del raphe del rombencefalo, dove producono serotonina (5-HT) mediante l’attività dell’enzima chiave e limitante Triptofano idrossilasi 2 (Tph2), espresso selettivamente in questo tipo neuronale. I neuroni serotoninergici innervano l’intero sistema nervoso centrale (SNC) formando una vasta rete di connessioni implicate in numerose funzioni fisiologiche e comportamentali. L’alterato funzionamento della neurotrasmissione serotoninergica può essere associato ad alcune patologie neuropsichiatriche quali l’ansia, la depressione, la schizofrenia e l’autismo.
Le cellule staminali embrionali (embryonic stem cells, ESCs) derivano dalla massa cellulare interna di embrioni di mammifero allo stadio di blastocisti. Le principali caratteristiche delle ESCs sono l’autorinnovamento, la capacità cioè di replicare indefinitamente senza differenziarsi, e la totipotenza, la potenzialità di originare ogni tipo cellulare dell’individuo adulto in risposta a specifici stimoli. Queste caratteristiche permettono la coltura delle ESCs e il loro differenziamento in vitro verso tutti i tipi cellulari, come ad esempio le cellule del sangue, muscolari e neuroni.
Ad oggi non è ancora stato del tutto compreso il meccanismo molecolare che regola il differenziamento verso neuroni serotoninergici durante lo sviluppo. La possibilità di generare neuroni serotoninergici in vitro offre un modello ideale per studiare lo specifico microambiente chimico-fisico extracellulare e i meccanismi molecolari intracellulari implicati nel differenziamento verso neuroni serotoninergici, infatti l’accessibilità dei modelli in vitro consente di testare gli effetti di diversi farmaci e di particolari substrati chimico-fisici sul differenziamento di tali neuroni. Questo modello potrebbe quindi contribuire alla comprensione delle alterazioni della neurotrasmissione serotoninergica che sono supposte essere all’origine di alcune patologie neuropsichiatriche.
Il modello sperimentale che ho utilizzato durante il mio tirocinio consiste nella linea di ESCs di topo geneticamente ingegnerizzate Tph2::eGFP, in cui la regione codificante di un gene reporter vitale quale la proteina verde fluorescente (enanched Green Fluorescent Protein, eGFP), è posta sotto il controllo trascrizionale del promotore del gene che codifica per Tph2. Le ESCs Tph2::eGFP, in seguito al differenziamento in neuroni serotoninergici, esprimono il gene Tph2 e conseguentemente, per la particolare ingegnerizzazione, attivano la proteina fluorescente eGFP. Perciò la linea Tph2::eGFP rende possibile rilevare e monitorare in tempo reale la progressione del differenziamento serotoninergico in vitro mediante microscopia a fluorescenza.
Il mio lavoro di tesi si è concentrato nella caratterizzazione dei neuroni serotoninergici differenziati in vitro a partire da ESCs Tph2::eGFP mediante analisi molecolari, morfologiche, morfometriche e funzionali allo scopo di verificare se le proprietà di tali neuroni rispecchiassero quelle dei neuroni serotoninergici presenti in vivo. Attraverso esperimenti di immunocitochimica (ICC) ho potuto verificare come tutti i neuroni fluorescenti differenziati in vitro presentino le caratteristiche molecolari tipiche dei neuroni serotoninergici differenziati in vivo: entrambi i tipi di neuroni sono post mitotici in quanto sono positivi per la presenza del marcatore Neuronal Nuclei (NeuN), e possiedono il corredo molecolare per la sintesi di 5-HT (Tph2) e per il suo accumulo nelle vescicole sinaptiche (VMAT2). Inoltre sono positivi per il trasportatore della serotonina (SERT), necessario per la ricaptazione di 5-HT extracellulare. Successivamente ho analizzato le caratteristiche morfologiche e morfometriche dei neuroni serotoninergici differenziati in vitro riscontrando che ricalcano quelle dei neuroni serotoninergici differenziati in vivo. Mediante la tecnica di registrazione elettrofisiologica “patch clamp whole cell”, ho potuto non solo verificare che i potenziali di riposo dei neuroni serotoninergici differenziati in vitro si attestano a valori paragonabili a quelli dei neuroni differenziati in vivo, ma anche accertare la presenza di canali voltaggio-dipendenti funzionali a livello della membrana plasmatica del corpo cellulare. Infine, le metodologie di calcium imaging accoppiate alle stimolazioni di veratridina, un alcaloide steroideo capace di aprire selettivamente i canali sodio voltaggio dipendenti e di prevenirne l'inattivazione, mi hanno consentito di rilevare nei neuroni serotoninergici differenziati in vitro la presenza di alcuni caratteri funzionali tipici dei neuroni maturi, come i canali ionici di membrana voltaggio-dipendenti per il sodio e per il calcio, confermando alcuni dei risultati ottenuti mediante la tecnica del patch clamp whole cell.
Grazie al modello in vitro messo a punto è quindi possibile generare neuroni serotoninergici fluorescenti che possono essere visualizzati in tempo reale e che riproducono le caratteristiche fondamentali dei neuroni serotoninergici presenti in vivo. Ciò permette una più agevole analisi dei parametri molecolari, morfologici e fisiologici dei neuroni serotoninergici rispetto ai modelli in vivo. Infine, queste peculiarità del modello in vitro ci potranno permettere, per esempio, di sperimentare gli effetti di diversi trattamenti farmacologici che influiscono sul differenziamento e sul funzionamento dei neuroni serotoninergici.