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La γ-glutamiltransferasi è un enzima espresso sulla membrana plasmatica di tessuti diversi all’interno del medesimo organismo, con la funzione di catalizzare il primo passaggio del processo di degradazione del glutatione (GSH) extracellulare attraverso la scissione del legame γ-glutammilico. Poiché tale enzima è localizzato sulla superficie esterna della membrana plasmatica, si ritiene che esso svolga un ruolo chiave nella captazione da parte delle cellule dei precursori per la sintesi del glutatione intracellulare. La determinazione dell'attività della gamma-glutammiltransferasi (GGT) nel siero è un esame di laboratorio utilizzato per valutare la funzionalità epatica, poiché il suo innalzamento è stato osservato in seguito a colestasi, steatosi, abuso di alcool, ma anche in epatopatie virali ed epatocarcinoma. In diversi studi è stata messa in evidenza l'eterogeneità della GGT sierica, infatti sono presenti diverse forme di GGT con caratteristiche chimico-fisiche diverse non ancora definite.
Nel laboratorio in cui è stata svolta la presente tesi, è stata messa appunto una tecnica che permette di separare quattro frazioni di GGT plasmatica tramite cromatografia per esclusione molecolare, e di rilevarne in modo selettivo e sensibile l'attività mediante una reazione enzimatica post-colonna. Cosi sono stati identificati tre complessi ad alto peso molecolare dotati di attività GGT, nominati big-GGT, (b-GGT; PM>2000 kDa), medium-GGT (m-GGT, PM=940 kDa), small-GGT (s-GGT; PM=140 kDa) e una quarta frazione, free-GGT (f-GGT; PM=70 kDa), con un peso molecolare compatibile con l'enzima libero.
Questa tecnica ha come fine l'approfondimento dello studio della natura dei complessi responsabili del trasporto della GGT nel plasma. I dati ottenuti finora (caratteristiche chimico-fisiche, suscettibilità a detergenti e all’azione proteolitica della papaina) supportano l’ipotesi che in b-GGT la proteina potrebbe essere inclusa in microvescicole (esosomi), m-GGT e s-GGT invece presentano un comportamento compatibile con la presenza di micelle di acidi biliari e GGT, e f-GGT è una forma di GGT solubile, priva del peptide idrofobico N-terminale. La GGT sierica è riportato essere di origine prevalentemente epatica, come suggerito dagli studi condotti nel 1981 da Huseby e collaboratori nei quali è stato dimostrato che la GGT sierica presenta le stesse caratteristiche chimico-fisiche di quella estratta dal fegato.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di descrivere il rilascio in vitro delle frazioni di GGT da parte di sferoidi di cellule HepG2 mediante la tecnica cromatografica. La linea cellulare HepG2 è una linea continua che deriva dal tessuto del fegato di un ragazzo di 15 anni, americano con un carcinoma epatocellulare ben differenziato e conserva alcune funzioni del fegato umano. Queste cellule hanno una morfologia di tipo epiteliale e secernono una varietà di proteine plasmatiche importanti. Le cellule HepG2 sono un adeguato sistema di modello in vitro per lo studio della polarizzazione degli epatociti umani. Infatti, con condizioni di coltura appropriate, nelle cellule HepG2 si può visualizzare una robusta differenziazione morfologica e funzionale, con una formazione controllabile di domini di superficie cellulare apicale e basolaterale che assomigliano rispettivamente al canalicolo biliare e ai domini sinusoidali, in vivo. Per il loro alto grado di differenziazione morfologica e funzionale in vitro, le cellule HepG2 sono un modello adatto per studiare il traffico intracellulare e la dinamica del canalicolo biliare, delle proteine di membrana sinusoidali e del metabolismo dei lipidi.
Gli sferoidi multicellulari, invece, rappresentano una delle modalità di crescita in vivo del tessuto neoplastico maligno, del tessuto di granulazione, ed in generale dei tessuti nella guarigione delle ferite, e rappresentano un microambiente molto poco conosciuto, nel quale operano numerosi fattori (per primo l'ipossia) capaci di modificare il differenziamento cellulare, i meccanismi di morte, la sensibilità agli agenti chemioterapici ed alla radioterapia. Le cellule coltivate come sferoidi hanno dimostrato di poter costituire strutture tridimensionali interpretabili dal punto di vista istopatologico, ed hanno rivelato capacità funzionali più simili al corrispondente tessuto in vivo che ai monostrati cellulari.
In particolare, per quanto concerne il rilascio di frazioni di gamma-glutamiltransferasi, gli sferoidi hanno dimostrato un profilo sovrapponibile a quello che si osserva nel plasma umano, profilo che non si osserva coltivando le stesse cellule in monostrato. Infatti dai risultati ottenuti è emerso che negli sferoidi si ha rilascio della frazione s-GGT e soprattutto f-GGT, profilo analogo al comportamento del tessuto in vivo. Il fatto che la frazione s-GGT sia presente nelle colture di sferoidi ma non nel monostrato suggerisce che la formazione di spazi canalicolari tridimensionali sia un evento necessario per la formazione di un microambiente adatto al processamento della forma di GGT ad alto peso molecolare. Nell’analisi western blot eseguita su sferoidi e monostrato sono state identificate due bande nel primo caso ed una sola nel secondo: la banda più pesante compatibile con GGT compresa del peptide di inserzione; quella più leggera compatibile con la forma libera. Provando ad effettuare un lavaggio degli sferoidi, si osserva la scomparsa della banda leggera.
In conclusione i risultati ottenuti dimostrano che gli sferoidi di cellule HepG2 sono un buon modello per lo studio in vitro della secrezione delle frazioni di GGT e portano ad ipotizzare che le forme di GGT a basso peso molecolare derivino da una modificazione extracellulare, dentro il canalicolo biliare, della forma ad alto peso molecolare.
Come prova supplementare del lavoro, è stata verificata la possibilità di alterare il profilo delle frazioni rilasciate mimando in vitro le condizioni di steatosi e danno da etanolo; per questo gli sferoidi sono stati trattati con acido oleico o etanolo. Dai risultati non è emersa alcuna differenza statisticamente significativa tra i controlli ed i trattati.
Poiché sono state messe a punto le condizioni idonee di coltura, studi futuri saranno volti a verificare gli effetti (a diverse concentrazioni) di sostanze note alterare in vivo la secrezione di GGT da parte degli epatociti, accompagnati dall’analisi istologica dello sferoide.