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Recentemente è emersa la possibilità di studiare un nuovo organismo modello nell’ambito della ricerca sull’invecchiamento, il pesce annuale Nothobranchius furzeri, il quale presenta notevoli vantaggi: ha un’aspettativa di vita eccezionalmente breve, che correla con la rapidità con cui entra nella fase riproduttiva e con il sopraggiungere di cambiamenti morfologici, istologici e comportamentali tipici dell’invecchiamento, come la comparsa di tumori o la degenerazione del tessuto nervoso.
Nell’ambito della linea di ricerca basata sullo studio dell’invecchiamento in questo nuovo organismo modello, un recente studio ha evidenziato come i microRNA, corte molecole di RNA che ad oggi sono ritenute importanti poiché coinvolte in diversi processi fisiologici e patologici della cellula e dell’individuo, abbiano la possibilità di svolgere un ruolo nell’ invecchiamento di N. furzeri: è emerso, infatti, come un certo numero di microRNA risulti essere espresso in modo correlato all’età degli animali analizzati, sia in N. furzeri che nel modello classico più filogeneticamente affine ad esso, Danio rerio.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di ricercare ed analizzare l’effetto biologico di alcuni dei microRNA emersi come probabilmente implicati nel processo di invecchiamento. Pertanto, sono stati presi in esame alcuni microRNA la cui espressione genica aumenta all’aumentare dell’età dei pesci: miR-15a, miR-23a, miR-26a, miR-29a, miR-101a, miR-145 e miR-338. Per confermare l’ipotesi che questi microRNA, noti per la loro funzione di onco-soppressori nell’ambito della regolazione dei geni che controllano il ciclo cellulare, svolgano un ruolo nell’invecchiamento, è stato scelto di utilizzare il sistema modello D. rerio, e nello specifico il sistema nervoso: si è voluto validare la supposizione che microRNA tipici dell’invecchiamento causino un prematuro differenziamento neuronale in larve di uno e due giorni di età, cosa resa possibile dal fatto che questo pesce completa l’organogenesi entro il terzo giorno di vita.
I microRNA sono stati microiniettati in uova di D. rerio allo stadio di 1-4 cellule, per poi analizzarne l’eventuale effetto agli stadi di 24h e 48h. L’analisi è stata svolta in un primo momento da un punto di vista morfologico, per designare i microRNA che potessero rivelarsi buoni candidati per successive indagini funzionali: sono stati scelti miR-15a, miR-29a, e miR-101a, date alcune evidenze fenotipiche che potevano ben correlare con la supposta azione delle molecole iniettate. L’indagine funzionale è stata messa in atto tramite la tecnica dell’ immunoistochimica “whole mount”, volta a evidenziare sia prodotti tipici di neuroni differenziati in modo terminale che proteine tipiche dei neuroblasti, cellule ancora in grado di dividersi attivamente. L’utilizzo del microscopio confocale e di editor grafici ha permesso di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano come gli embrioni trattati presentino un rapporto tra neuroni differenziati e neuroblasti con ogni probabilità maggiore rispetto ai non trattati, nonché una localizzazione non conforme alla norma dei neuroni differenziati.
Al fine di corroborare il dato suggerito dall’esito di questi esperimenti, è stato analizzato l’effetto dei microRNA anche a stadi di sviluppo precedenti alle 24h: se embrioni di 10h e 11.5 h microiniettati non mostrano la presenza di neuroni differenziati, come i non trattati, embrioni di 14h mostrano la presenza di uno scarso numero di neuroni differenziati, cosa che non risulta nei non trattati. Questo dato e i precedenti mostrano come probabilmente l’effetto dei microRNA invecchiamento-specifici presi in esame sia quello di contribuire, attraverso meccanismi da chiarire, al differenziamento delle cellule nervose.