• traditional cheeses
• Staphylococcus aureus
• Lactobacillus plantarum
• formaggi tradizionali
• biopreservation
• bioconservazione
• batteriocine
• bacteriocin

Il microbiota di alimenti fermentati tradizionali, prodotti senza l’uso di starter, può essere una fonte preziosa di batteri lattici autoctoni con potenziali applicazioni come colture bioprotettive. In questo studio 100 ceppi di batteri lattici isolati da pecorini a latte crudo e salami tradizionali prodotti in Toscana sono stati valutati per la produzione di batteriocine in vitro. Il surnatante purificato dei ceppi coltivati in idoneo brodo di coltura è stato testato verso un panel di microorganismi tramite “agar well diffusion assay” (AWDA). Per il 5% dei ceppi è stata evidenziata un’attività antimicrobica batteriocina-correlata. Il surnatante di L.plantarum LPU4, identificato tramite test fenotipici e PCR specie-specifica, ha mostrato un’azione inibente verso isolati di S.aureus con caratteristiche di antibiotico-resistenza, incluso un ceppo MRSA (meticillin-resistant Staphylococcus aureus), per questo motivo è stato selezionato per una ulteriore caratterizzazione. L’attività nel surnatante di L.plantarum LPU4 è rimasta immutata dopo trattamento con catalasi mentre non è stata rilevabile dopo l’aggiunta di proteinasi K, pepsina e pronasi, mostrando la natura proteica dell’effetto inibente. Una banda peptidica bioattiva con massa approssimata di 6 kDa è stata rilevata attraverso tricina-SDS PAGE e biosaggio delle proteine semi-purificate del surnatante. La successiva analisi MALDI-TOF della banda escissa dal gel di elettroforesi ha confermato la presenza di una proteina con massa molecolare di 4866.7 Da. Il “peptide mass fingerprint” ottenuto dalla digestione triptica della proteina è stato confrontato con quelli presenti nei maggiori databases e ha permesso di stabilire che la batteriocina prodotta da L.plantarum LPU4 non aveva omologie con altre batteriocine note, di conseguenza questa nuova batteriocina è stata chiamata plantaricina LPU4. La plantaricina LPU4 si è mostrata termoresistente (87% di attività residua dopo 15 minuti a 121°C) e la sua attività non è stata inibita da detergenti (Tween 20, SDS, Triton X100), da sali (EDTA, NaCl) e da prolungata esposizione a un largo range di pH (2-12). I geni implicati nella sintesi della plantaricina LPU4 sono stati localizzati a livello plasmidico, come dedotto dalla perdita di produzione e dell’autoimmunità dopo il curing del ceppo. La batteriocina ha mostrato un modo di azione batteriostatico e un’attività incrementata in soluzioni acide. La massima produzione (3200 AU/ml-1) è stata raggiunta durante la fase tardo-esponenziale di crescita di L.plantarum LPU4 ed è rimasta costante fino a 48 ore. Brodi di coltura con pH iniziale tra 5.5 e 6.2 hanno aumentato significativamente la produzione della plantaricina, così come l’aggiunta al terreno di sostanze con attività tamponanti nei confronti dell’abbassamento del pH legato alla produzione di acidi organici durante la crescita. Allo stesso modo, temperature di incubazione relativamente basse (15°C-25°C) rispetto all’optimum per la crescita (30°C) hanno determinato una produzione significativamente più alta della plantaricina, mentre a 37°C non è stata rilevata la presenza di attività inibente.
La plantaricina LPU4 ha mostrato: 1) un incremento dell’efficacia a valori di pH uguali a quelli registrati nel pecorino da cui era stata isolata, 2) un’attività antimicrobica non inibita da NaCl, 3) una produzione aumentata da condizioni di pH e temperatura riscontrabili nella matrice durante la stagionatura; per questi motivi può essere considerata un buon candidato per ulteriori studi mirati all’applicazione tecnologica come cultura bioprotettiva nei pecorini tradizionali a latte crudo toscani.