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Tesi etd-03242011-162248
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Tipo di tesi Tesi di laurea specialistica
Autore AZARA, DANILO
URN etd-03242011-162248
Titolo Studio dei meccanismi che mediano l'angiogenesi indotta da ipossia, mediante l'utilizzo di un modello in vitro di cellule endoteliali umane: regolazione del sistema del VEGF e coinvolgimento del sistema somatostatinergico
Settore scientifico disciplinare SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI, FACOLTA'
Corso di studi SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
Nome Commissario Qualifica
Prof. Paola Bagnoli relatore
Parole chiave
  • Angiogenesis; endothelial cells; VEGF and its rece
Data inizio appello 2011-04-14
Disponibilità mixed
Data di rilascio2051-04-14
Riassunto analitico
L’angiogenesi rappresenta un insieme di processi funzionali atti alla formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli preesistenti ed è un complesso meccanismo in cui ha un ruolo molto importante, la proliferazione, differenziazione e migrazione delle cellule endoteliali dei vasi. L’angiogenesi non è solamente un processo fisiologico, ma è anche alla base di numerosi stati patologici come la progressione dei tumori, la retinopatia dei prematuri e la retinopatia diabetica. Il fattore di crescita delle cellule endoteliali vascolari (VEGF) è uno dei piu’ potenti fattori pro-angiogenici. L’azione pro-angiogenica del VEGF è mediata dalla sua interazione con due recettori tirosina chinasi (VEGFR-1 e VEGFR-2) ed è noto che l’over-espressione del VEGF è una delle principali cause alla base della neoangiogenesi. E’ stato dimostrato che l’ ipossia è uno dei principali stimoli in grado di indurre l’over-espressione del VEGF e di conseguenza promuovere una patologica angiogenesi. Tuttavia, molto resta ancora da comprende circa i meccanismi che regolano il sistema del VEGF in condizioni ipossiche. Studi recenti hanno dimostrato che la molecola nota come trasduttrice del segnale ed attivatrice della trascrizione 3 (STAT3) è coinvolta in una varieta’ di processi biologici, tra cui l’angiogenesi. In particolare, è stato dimostrato che la fosforilazione di STAT3 modula l’espressione e l’attivita di VEGF nelle cellule endoteliali vascolari. Il peptide somatostatina (SRIF) è espresso in diversi organi e tessuti ed agisce attraverso cinque recettori del tipo accoppiato a proteine G (sst1-5). Diverse evidenze indicano che la SRIF puo’ esercitare importanti effetti anti-angiogenici. Tuttavia, non è chiaro se e come l’espressione dei recettori ssts è modulata dall’ipossia. Inoltre, non è noto se e come in condizioni di ipossia la SRIF puo’ inibire la neoangigenesi attraverso la modulazione del sistema del VEGF. Utilizzando un modello in vitro di cellule endoteliali di cordone Ombelicale umano (HUVEC) rese ipossiche, lo scopo del nostro lavoro è stato quello di a) fornire ulteriori meccanismi che regolano il sistema del VEGF in condizioni ipossiche, b) chiarire l’effetto dell’ipossia sull’espressione dei recettori ssts e di studiare se e come la SRIF modula il sistema del VEGF in condizioni ipossiche.
Le HUVEC sono state seminate in apposite fiasche di coltura in grado di consentire gli scambi gassosi. In condizioni normossiche le cellule sono state mantenute al 20% O2 e 5% CO2 La condizione ipossica è stata ottenuta utilizzando uno specifico incubatore a CO2 in grado di mantenere la percentuale di O2 all’1%. Nei nostri esperimenti in condizioni normossiche od ipossiche, sono state utilizzate HUVEC al passaggio 3 – 8 ed al 70% di confluenza per garantirne le capacita’ proliferative. Le cellule sono state trattate in presenza o assenza di SRIF (si lega a tutti i recettori ssts), CH-275 (agonista selettivo di sst1) o L-803,97 (agonista selettivo di sst4) per 24h. L’effetto osservato in presenza o assenza di SRIF, CH-275 ed L-803,97 è stato inoltre studiato in presenza o assenza di uno specifico inibitore del VEGFR-2 (SU1498) o dell’ inibitore di STAT3 (STAT3 inhibitor VI, S3I-201) per 24h. Tramite Real time RT-PCR abbiamo misurato l’espressione dell’mRNA di VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 ed sst1-5.
In condizioni normossiche, nelle HUVEC abbiamo osservato l’espressione dell’mRNA di VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, sst1 ed sst4, mentre l’mRNA di sst2, 3, 5 non è stato osservato. L’ipossia ha indotto un significativo aumento dell’mRNA di VEGF ed sst4 e la significativa riduzione dell’mRNA di VEGFR-1, VEGFR-2 ed sst1. L’incremento dell’mRNA del VEGF indotto dall’ipossia è risultato abolito in presenza di SU1498 o S3I-20. L’inibizione dell’mRNA di sst1 in condizione ipossica è risultata abolita da SU1498 e parzialmente, ma significativamente, ridotta da S3I-20. Al contrario, il livello dell’mRNA di VEGFR-1, VEGFR-2 ed sst4 indotti da ipossia non sono stati influenzatoi da SU1498 o S3I-20. Questi risultati suggeriscono che l’overespressione di VEGF indotta da ipossia possa autoalimentarsi attraverso l’attivazione di VEGFR-2 e forniscono l’indicazione che l’attivazione del VEGFR-2 inibisce l’espressione di sst1. In aggiunta, SRIF e CH hanno abolito l’incremento di VEGF ed hanno promosso l’ incremento del livello di mRNA di VEGFR-1, rispetto a quanto osservato in condizioni ipossiche. Il livello dell’mRNA di VEGFR-2 indotto da ipossia è risultato incrementato solo in presenza di SRIF. L-803,97 non ha modificato l’espressione di VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 in condizioni ipossiche. Questi dati suggeriscono che la SRIF è in grado di modulare il sistema del VEGF in condizioni ipossiche e che il recettore sst1 riveste un ruolo molto importante in questa azione.
In conclusione, il nostro lavoro indica che la SRIF esercita un importante azione antiangiogenica prevenedo gli effetti dell’ ipossia sul VEGF ed i suoi recettori, e suggerisce che sst1 possa rappresentare un importante bersaglio per nuovi approcci terapeutici diretti a contrastare lo sviluppo di una patologica neaoangiogenesi.
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