• Varianti di Splicing
• Mutagenesi sito specifica
• Lievito
• Brca1

Il cancro al seno rappresenta la forma di neoplasia più comune nel mondo occidentale con un’incidenza stimata di 6 donne su 100. Circa l’80% dei casi è dovuto a delle forme sporadiche diagnosticate in donne che non presentano nessuna associazione di cancro familiare. La rimanente percentuale afferisce a forme di cancro ereditario e, fra queste, circa il 40% sono ascrivibili a mutazioni in BRCA1 e BRCA2. BRCA1(Breast Cancer Type 1 susceptibility protein), un tumor suppressor gene, codifica per una fosfoproteina coinvolta in molte funzioni cellulari che includono un ruolo attivo nella progressione del ciclo cellulare, nella trascrizione e nella riparazione del DNA. BRCA1 è un gene altamente polimorfico; più di 1.500 varianti uniche annotate nei vari database. Negli ultimi anni sono state descritte in letteratura molte varianti di splicing del gene BRCA1, identificate anche in tessuti sani. La funzione biologica di queste varianti e il loro possibile coinvolgimento nella tumorigenesi e progressione del cancro rimangono ancora sconosciute. Sebbene la maggior parte di queste varianti dia origine a delle forme tronche e non funzionali della proteina stessa, associate ad un incremento del rischio di sviluppo di cancro al seno, la problematica maggiore risulta essere quella di determinare l’impatto delle varianti rappresentate principalmente da mutazioni missenso, causate da singole variazioni aminoacidiche o da delezioni/ inserzioni in frame. La ricerca di nuove metodologie in grado di determinare l’impatto e il ruolo biologico di queste varianti ha portato allo sviluppo di numerosi saggi funzionali; il loro proposito è quello di rappresentare dei “classificatori” indipendenti in grado di determinare l’influenza delle varianti sulla funzione biologica della proteina, generando delle informazioni accessorie da integrare con i dati epidemiologici e genetici presenti nei vari database. Il mio lavoro di tesi s’inserisce in queste problematiche biologiche e ha avuto come obiettivi principali la generazione delle varianti di splicing “in frame”, delta 9-11, delta 11 e delta 11q e la validazione di un saggio funzionale che indagasse l’attività biologica delle varianti missenso di BRCA1. L’organismo modello utilizzato sia per costruire e caratterizzare le varianti di splicing è il lievito Saccharomyces cerevisiae, in particolare il ceppo diploide RS112. Le varianti di splicing, assemblate per ricombinazione omologa e clonate all’interno di vettori plasmidici, sono state espresse nel ceppo diploide di lievito RS112. E’ stato studiato l’effetto biologico dell’espressione di queste varianti di splicing mediante il saggio “Small Colony Assay”. Questo si basa sull’evidenza che l’espressione di BRCA1 nel lievito provochi un rallentamento nella crescita, dando origine a colonie di dimensioni ridotte probabilmente dovuto ad un effetto tossico. Studi di letteratura hanno dimostrato come il fenotipo misurato in questo saggio, sviluppato inizialmente per analizzare mutazioni presenti nel dominio c-terminale (BRCT) del gene, sia in realtà da associare con la formazione di aggregati nucleari adopera di BRCA1 nel lievito. Le varianti di splicing testate durante il mio lavoro di tesi hanno indotto la formazione di colonie di dimensione normali, suggerendo un’impatto sulla funzione di BRCA1. Per validare il saggio di ricombinazione proposto dieci anni fa, come test preclinico per determinare l’effetto di varianti missenso di BRCA1, abbiamo generato mediante tecniche di mutagenesi sito-specifica e espresso numerose varianti missenso BRCA1, localizzate nella coding sequence. I risultati ottenuti confermano che, in questo sistema genetico, alcune varianti patogenetiche di BRCA1, in particolare quelle che si trovano sui domini BRCT al C-terminale, aumentano la ricombinazione. I risultati ottenuti potrebbero essere attribuiti in parte ad un folding errato della proteina che potrebbe compromettere il funzionamento corretto del dominio BRCT. Ulteriori esperimenti sono in corso per investigare ulteriormente il possibile effetto delle varianti di splicing sulla ricombinazione. Nel complesso, questo studio conferma ancora una volta, come il sistema modello lievito possa rappresentare uno strumento valido per un pre-screening di varianti di significato clinico incerto.