• TCL1
• linfoma
• Ibrutinib
• BTK

Con il termine “linfoma” si indica un insieme di malattie neoplastiche del tessuto normalmente presente nei linfonodi e nelle strutture linfoidi. La proliferazione neoplastica può interessare vari tipi di cellule in diversi stadi di maturazione dando luogo a cloni linfatici differenti e quindi a diversi quadri istopatologici e clinici. Il linfoma è un tumore che interessa i linfociti, cellule atte alla difesa dell’organismo, capaci di rispondere in maniera specifica alla presenza di un antigene.
I linfociti che subiscono difetti durante la crescita e la differenziazione, se non correttamente eliminati, possono portare alla generazione di cloni tumorali che, appartenendo al tessuto linfoide, prendono il nome di linfomi. Il clone tumorale è costituito da cellule che si dividono ripetutamente senza alcuna regolazione ed è quindi caratterizzato da uno sbilanciamento tra la formazione di nuove cellule e la distruzione cellulare (apoptosi).

Esistono due principali tipi di linfoma:
• Linfoma di Hodgkin (LH) o linfogranuloma maligno che trae origine da cellule del sistema monocito-macrofagico e che interessa prevalentemente il tessuto linfoide;
• Linfoma di non Hodgkin (LNH) che colpisce con una maggiore frequenza i soggetti con difetti immunologici primitivi. Il LNH risulta, inoltre, più resistente alla terapia antiblastica rispetto al LH. La forma più comune (30-40% dei casi) è il linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) recidivante o refrattario (R/R). Al contrario, una rara forma di linfoma maligno non Hodgkin è il linfoma a cellule mantellari (MCL), il quale origina nella zona mantellare dei linfonodi.

Le strategie terapeutiche variano in base alla tipologia di linfoma coinvolto, alla sua velocità di progressione e alle caratteristiche delle cellule cancerose.
In particolare, tra i target terapeutici più studiati per il trattamento del linfoma vi sono:
1. La proteina TCL1 (T cell leukemia/lymphoma 1A);
2. La tirosina chinasi di Bruton (BTK).

TCL1 è una proteina idrofobica di 13 kDa, codificata dall’oncogene TCL1, la cui deregolazione costituisce uno dei meccanismi alla base della linfomagenesi. Questa chinasi è infatti in grado di causare proliferazione linfocitaria incontrollata attraverso la co-attivazione del gene AKT, coinvolto nelle vie di crescita, sviluppo e sopravvivenza cellulare nonché nei meccanismi di angiogenesi e invasione tissutale. TCL1 inoltre attiva la fosforilazione di target a valle, come ATM (Ataxia Telencia Mutated), IkB (inhibitor of kappa B), HSP70 (Heat Shock Protein 70) e TP63 (Tumor Protein 63), aumentando la proliferazione cellulare e arrestando i processi pro-apoptotici.
BTK (Bruton's tyrosine kinase) è invece una chinasi coinvolta nella trasduzione del segnale del BCR pathway. Essa agisce mediante il legame di un antigene con il recettore di superficie BCR, la cui stimolazione porta SYK (Spleen tyrosine kinase) e LYN (tirosina chinasi della famiglia Src) ad attivare BTK. BTK a sua volta, è responsabile dell’attivazione della fosfolipasi PLCγ2 (1 fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato fosfodiesterasi), che promuove la produzione di diacilglicerolo (DAG) e inositolo trifosfato (IP3), mediatori coinvolti in due diverse vie di trasduzione del segnale alla base del normale differenziamento dei linfociti B in plasmacellule e “cellule della memoria immunologica”.
Il pathway BCR è regolato dall’ oncosoppressore PTPROt (Protein Tyrosine Phosphatase receptor-type O truncated), controllato da TCL1. E’ quindi evidente come una disregolazione a livello di TLC1 possa determinare la proliferazione incontrollata delle cellule cancerose e conseguente linfomagenesi.
La BTK è il target principale di Ibrutinib, un composto appartenente alla “prima generazione” di inibitori di BTK, il quale interagisce covalentemente e irreversibilmente con il residuo di Cys481 di BTK impedendone l’autofosforilazione a livello della Tyr223, processo necessario per la attivazione della chinasi. Ibrutinib è stato approvato dall’FDA nel 2013 per la terapia antitumorale nella leucemia linfatica cronica con delezione del cromosoma 17p ed altre neoplasie liquide tra cui il linfoma a cellule mantellari (MCL), il mieloma multiplo, il linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) e la Macroglobulinemia di Waldenstrӧm (WM).
Dal punto di vista strutturale, l’Ibrutinib è un 1-[(3R)-3-[4-ammino-3-(4-fenossifenil)pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-yl]piperidin-1-yl] prop-2-en-1-one. Studi computazionali hanno illustrato le interazioni tra i diversi gruppi farmacoforici dell’Ibrutinib e la proteina BTK. Le più importanti interazioni descritte sono indicate di seguito.
• La formazione di un legame a idrogeno tra l’azoto del gruppo amminico dell’ibrutinib, con il Glu475 e con la Thr474 di BTK;
• L’azoto in posizione 3 della pirimidina forma un legame a idrogeno con la Met477 di BTK;
• Un legame covalente tra il gruppo acrilammidico dell’ibrutinib con la Cys481 del BTK;
• Numerose interazioni idrofobiche con differenti amminoacidi quali Leu528, Val416, Thr474, Ala428, Lys430 presenti nella tasca idrofobica laterale del BTK chiamata “gatekeeper”.
Il legame con la Cys481, covalente e irreversibile, è di cruciale importanza per l’attività della molecola. Infatti, mutazioni a carico di questo amminoacido diminuiscono la capacità del farmaco di inibire la fosforilazione di BTK mutante determinando così farmacoresistenza.
Le evidenze accumulate fino ad oggi sul ruolo rilevante giocato dalle chinasi TCL1 e BTK indicano che una strategia mirata a colpire entrambi i target potrebbe rappresentare un approccio terapeutico efficace contro le neoplasie linfocitarie, capace di superare i meccanismi di farmacoresistenza acquisita.
Sulla base di queste considerazioni, nel laboratorio dove ho svolto la mia tesi, sono stati sintetizzati analoghi strutturali dell’Ibrutinib opportunamente modificati per ottenere un’attività duale su entrambi i target, BTK e TLC1.
Le nuove molecole sintetizzate presentano un nucleo 6-(4-metossifenil)chinazolinonico variamente sostituito in posizione 2 con un gruppo N-metilpiperazinico (1a), un gruppo piperazinico (1b) e un gruppo N-acrilammidopiperazinico.(1c) e sostituito in posizione 8 con un fenile mantenuto in 1a, 1b e 1c.
La strategia sintetica seguita e la caratterizzazione degli intermedi e dei prodotti finali saranno oggetto di questa tesi di laurea.