• ottimizzazione
• Xenopus
• istone
• demetilasi

Lo sviluppo embrionale è un processo complesso e ben architettato, che consiste nell’organizzazione spazio-temporale specifica delle cellule embrionali. Ciò avviene grazie ad ordinate reazioni di signaling cellulare e regolazione dell’espressione genica, che guidano il differenziamento delle cellule e la loro proliferazione.
In questo contesto, è noto che il controllo epigenetico sugli istoni abbia un ruolo regolatorio sulle interazioni tra i fattori di trascrizione attivi durante lo sviluppo e i loro geni target. Gli istoni subiscono modifiche chimiche come acetilazione, metilazione, e fosforilazione, in seguito alle quali cambia lo stato di condensazione della cromatina; di conseguenza determinati geni o porzioni delle loro sequenze regolatrici, diventano più o meno accessibili per promotori, repressori ed il complesso molecolare della trascrizione.
Tuttavia, molto poco è noto sul ruolo svolto dal rimodellamento della cromatina durante lo sviluppo ed il differenziamento della retina. Nel laboratorio dove ho svolto la tesi è in corso lo studio della funzione del regolatore cromatinico Jhdm1d durante la retinogenesi di Xenopus laevis, un anfibio anuro, usato come animale modello nell’ambito della biologia dello sviluppo. La proteina codificata dal gene jhdm1d è una istone demetilasi specifica per le lisine 27 e 9 mono- e di- metilate dell’istone H3, modifica associata a repressione della trascrizione. È quindi probabile che questa proteina abbia un ruolo nello sviluppo e differenziamento della retina, tale ipotesi è supportata anche dal fatto che jhdm1d è regolato positivamente da rx1, uno dei geni master per lo sviluppo della retina di Xenopus.
Nella mia tesi è proseguita l’indagine, iniziata da alcuni anni, sugli effetti della sovraespressione di Jhdm1d per quanto riguarda la variazione delle diverse popolazioni di cellule retiniche. Secondo protocolli ben stabiliti in letteratura, l’mRNA d’interesse viene iniettato in un blastomero precoce la cui progenie partecipa solo in piccola parte alla generazione dei progenitori retinici che daranno origine a tutti i tipi cellulari della retina. In questo modo è possibile ottenere distinti cloni retinici che sovraesprimono la proteina d’intesse ed è quindi possibile capire se questa abbia un effetto sulla generazione di tipi cellulari specifici. In un primo momento abbiamo iniettato l’mRNA trascritto in vitro di jhdm1d nel blastomero D1.2 negli embrioni a stadio di 16 cellule, insieme all’mRNA della green fluorescent protein (GFP) che ha il ruolo di tracciante. A stadio 42, quando la retinogenesi è terminata, gli embrioni sono fissati in paraformaldeide, crioprotetti, inclusi e quindi sezionati al criostato. Sulle sezioni ottenute si esegue una colorazione nucleare con Hoechst, e mediante microscopia a fluorescenza si contano il numero di cellule GFP-positive che vengono anche identificate in base alla loro morfologia e posizione retinica.
Durante l’esecuzione degli esperimenti abbiamo notato un elevato tasso di mortalità degli embrioni iniettati rispetto ai controlli. Dopo alcune osservazioni abbiamo concluso che la causa potesse essere il volume di iniezione e il conseguente stress meccanico a cui è sottoposto il blastomero. Abbiamo quindi individuato una più bassa quantità alla quale la mortalità degli embrioni risultava considerevolmente ridotta. Altro risultato di questa modifica è stato una più uniforme espressione della GFP (misurata con il valore dell’intensità luminosa) tra gli embrioni, rispetto a quella ottenuta in origine.
Come conseguenza della sovraespressione di jhdm1d abbiamo riscontrato una diminuzione in percentuale dei fotorecettori e una tendenza all’aumento delle cellule bipolari. I dati così ottenuti si discostano da alcuni degli esperimenti eseguiti precedentemente in laboratorio. Una spiegazione può essere il metodo di conta delle cellule che ha una parte soggettiva insita, dovuta alle differenze tra gli operatori e i loro metodi. Così abbiamo elaborato un metodo di conta che verte sulla misura dell’area (in pixel) che nelle immagini acquisite al microscopio a fluorescenza delle sezioni è sia blu (Hoechst), sia verde (GFP), ed è compresa nella retina escluso epitelio pigmentato e CMZ (ciliary marginal zone). Ho quindi eseguito le stesse misurazioni sulle fotografie degli embrioni iniettati da me e anche su quelle ottenute in laboratorio precedentemente alla mia tesi. Il risultato è che in entrambi i casi si perde la significatività statistica delle differenze precedentemente osservate, mentre si mantiene una tendenza apprezzabile solo per quanto riguarda la diminuzione dei fotorecettori da me contati.
Nel contempo si è continuato l’esperimento iniettando anche l’mRNA trascritto in vitro del gene jmjd3, un’altra istone demetilasi che ha come bersaglio la lisina 27 di- e tri-metilate dell’istone H3, e che quindi fornisce substrati a Jhdm1d. L’analisi dei risultati di questo esperimento è tutt’ora in corso.
Al fine di ottenere una quantificazione più oggettiva degli effetti del trattamento si è pensato, come approccio complementare, all’utilizzo di una real time-RTPCR per misurare l’espressione di RNA specifici per i singoli tipi cellulari. Gli embrioni vengono iniettati, con gli stessi mRNA dei punti precedenti, allo stadio di 8 cellule in uno dei blastomeri dorsali del polo animale per ottenere una popolazione clonale maggiore all’interno della retina. Quando gli embrioni arrivano a stadio 42, in anestesia, viene espiantato l’occhio dal lato iniettato e da questo viene estratto l’RNA totale che sarà poi retrotrascritto. Con il cDNA si esegue una real time-PCR utilizzando primer specifici per i vari marcatori dei tipi cellulari retinici, confrontando poi controlli e trattati. L’esperimento, già messo a punto dal punto di vista tecnico con occhi di tipo wild-type non iniettati, è attualmente in corso.