• saggio funzionale
• Saccharomyces cerevisiae
• Varianti missenso

La rapida evoluzione delle tecnologie di sequenziamento ha permesso l’identificazione di varianti geniche rare e comuni presenti nel genoma umano. Ciò impone la necessità di classificare le numerose varianti di significato funzionale incerto (VUS) e distinguere gli alleli ad alto rischio da quelli senza rischio per determinare il loro impatto sulla salute.
Tradizionalmente, le varianti della linea germinale appena scoperte e sospette di essere patogenetiche sono sottoposte a test applicabili a tutti i geni come analisi di segregazione, storia familiare, frequenza nella popolazione, perdita di eterozigosi e test gene-specifici. Lo sviluppo di strumenti di predizione computazionali è stato il centro di un’intensa ricerca, ma si è rivelato insufficiente e non totalmente affidabile. La valutazione diretta usando saggi funzionali può aiutare nella classificazione delle varianti ed è uno strumento utile alla conferma delle predizioni computazionali. Inoltre, i saggi funzionali sviluppati in sistemi genetici semplici possono aiutare ad accelerare la valutazione funzionale delle nuove varianti individuate come associate al cancro.
L’uomo e il lievito Saccharomyces cerevisiae condividono migliaia di geni sebbene stiano divergendo da bilioni di anni. L’umanizzazione del lievito può essere utile per decifrare le conseguenze funzionali di varianti genetiche umane trovate nel cancro e per dare informazioni riguardo la patogenicità delle varianti missenso. L’umanizzazione del lievito può essere fatta con diversi approcci a seconda del gene che si vuol studiare. In particolare, per i geni umani che hanno un omologo in lievito si può introdurre una sostituzione simile a quella del gene umano nel gene di lievito. Per i geni che non hanno un omologo si esprime la proteina eterologa nella sua forma wild type o mutata. In questo lavoro di tesi il primo approccio è stato utilizzato per caratterizzare mutazioni del gene MSH6 che è associato al tumore colorettale ereditario non poliposico. Il secondo approccio è stato utilizzato per il gene BRCA1 che è associato a tumore familiare al seno e ovario. Lo scopo finale di questo studio è quello di potenziare l’uso del lievito come sistema modello per caratterizzare mutazioni associate a tumore. I geni presi in considerazione nel nostro studio codificano per proteine coinvolte nei meccanismi di riparazione del DNA; questi pathway si trovano nell’organismo modello S. cerevisiae rendendolo adatto per mettere a punto saggi funzionali che consentiranno di discriminare le varianti patogenetiche da quelle neutre.
Al fine di costruire il sistema per caratterizzare le mutazioni nel gene MSH6 abbiamo creato il ceppo RSY6msh6::pCORE, in cui il gene è interrotto dall’inserimento di una cassetta CORE e, quindi, non è più funzionale. Il ceppo creato presenta un fenotipo mutatore, misurato come incremento della frequenza di reversione genica nel gene ilv1-92 e arg4-3. Per ottenere le varianti del gene MSH6 è stato dapprima costruito un vettore contenente il gene wild type e poi mutato mediante mutagenesi sito-specifica. Quindi, i ceppi di lievito contenenti mutazioni corrispondenti alle varianti missenso MSH6 saranno costruiti tramite gene targeting. Le varianti MSH6 saranno valutate nel nostro sistema modello come neutre o patogenetiche in base alla loro capacità di ristabilire il fenotipo selvatico.
Il gene BRCA1 non ha l’omologo in lievito, per cui l’espressione viene mediata attraverso un vettore plasmidico tramite crescita in terreno contenente l’induttore specifico che in questo caso è il galattosio. Studi effettuati dal gruppo dove ho svolto la tesi, hanno dimostrato che, in lievito, l’espressione di varianti missenso di BRCA1 associate a tumore causano un aumento della ricombinazione e della reversione. Prima di determinare l’effetto di BRCA1 nel ceppo diploide RS112, abbiamo determinato il livello di espressione della proteina wild type o mutata in tutti i ceppi utilizzati. I risultati del Western blot mostrano l’espressione della proteina nel ceppo di lievito: questo è un risultato importante per validare il saggio funzionale.
In questo lavoro, sono stati costruiti una serie di vettori per esprimere in lievito varianti missenso, patogeniche o neutre, sempre mediante mutagenesi sito specifica. I plasmidi sono stati trasformati nel ceppo diploide RS112 che permette di determinare eventi di ricombinazione, intracromosomica e intercromosomica.
I risultati ottenuti confermano che nel nostro sistema genetico alcune varianti patogenetiche di BRCA1, in particolare quelle che si trovano sui domini BRCT al C-terminale, aumentano la ricombinazione.
Questo studio dimostra ancora che il sistema modello utilizzato può essere uno strumento valido per un pre-screening di varianti di significato clinico incerto.