• proteins
• memory
• long-term sensitization
• Leech

In questa tesi sono stati analizzati i meccanismi molecolari alla base della sensitizzazione a lungo termine (LT), nella sanguisuga Hirudo medicinalis.
H. medicinalis rappresenta un buon modello sperimentale per studiare i vari e complessi aspetti della funzionalità del sistema nervoso (SN), apprendimento e memoria inclusi, poiché associa alla semplicità anatomica comportamenti complessi organizzati in circuiti neurali semplici.
È stato utilizzato come atto comportamentale l’induzione al nuoto, ovvero l’induzione di un ciclo di nuoto in risposta ad un lieve stimolo elettrico (stimolo test) applicato sulla cute della porzione caudale dell’animale che aveva precedentemente subito la disconnessione microchirurgica del primo ganglio segmentale dal ganglio cefalico. Sottoponendo gli animali ad uno specifico protocollo di addestramento è stato possibile indurre sensitizzazione a breve (BT) e a lungo termine (LT). In una sessione di sensitizzazione, gli animali sono sottoposti a 4 stimoli test applicati ad intervalli random per valutare la risposta basale, quindi subiscono 15 spazzolate sul dorso (brushing) al termine delle quali viene nuovamente presentato lo stimolo test per tre volte ad intervalli di 5 minuti. Le risposte registrate dopo quest’ultimi risultarono potenziate rispetto alla risposta basale e tale potenziamento perdurava per almeno 40 minuti.
Se gli animali, dopo essere stati sottoposti il primo giorno a una seduta di sensitizzazione, ricevevano nei 4 giorni successivi stimoli nocicettivi ripetuti, rappresentati da serie di 15 spazzolate ripetute per 4 volte a distanza di 10 minuti, il sesto giorno durante una seconda sessione di sensitizzazione mostravano un incremento della risposta post brushing molto maggiore rispetto a quella registrata il primo giorno e tale potenziamento durava almeno 24 ore, indicando che era avvenuta sensitizzazione LT. Animali di controllo, sottoposti a sensitizzazione il primo e il sesto giorno ma solo manipolati a temperatura ambiente per la durata dell’applicazioni degli stimoli nocicettivi ripetuti durante i 4 giorni intermedi, il 6° giorno mostravano risposte agli stimoli test presentati dopo brushing del tutto sovrapponibili a quelle registrate il 1° giorno.
La somministrazione di cicloesimide, un inibitore della sintesi proteica, bloccava l’instaurarsi di sensitizzazione LT, suggerendo che la formazione ex-novo di proteine nel SN sia un meccanismo fondamentale per il consolidamento delle tracce mnemoniche nell’apprendimento LT.
L’analisi elettroforetica mediante SDS-PAGE condotta su pellet e surnatante ottenuti sonicando e in seguito centrifugando catene gangliari e ganglio caudale isolati da animali addestrati LT e di controllo, ha rilevato un diverso profilo proteico negli omogenati di tessuto nervoso ottenuti dagli animali sensitizzati LT rispetto agli animali di controllo.
Pellet e surnatante ottenuti sia da animali sensitizzati LT che da animali di controllo sono stati iniettati in animali naïve (sottoposti soltanto alla disconnessione microchirurgica del primo ganglio segmentale dal ganglio cefalico), precedentemente sottoposti ad una sessione di sensitizzazione. In una seconda sessione di sensitizzazione eseguita un’ora dopo l’iniezione, solo gli animali che avevano ricevuto il pellet derivato da animali sensitizzati LT hanno mostrato un potenziamento della risposta allo stimolo test dopo brushing, simile a quello ottenuto dopo ripetute stimolazioni nocicettive. Analogamente a quanto precedentemente osservato dopo sensitizzazione LT, tale potenziamento perdurava per 24 h e non si aveva se il pellet era stato ottenuto da omogenato di tessuto gangliare di animali sensitizzati LT e iniettati quotidianamente con cicloesimide 10 μM.
Campioni di pellet ottenuto da omogenati derivati da catene gangliari di animali sensitizzati LT e di animali di controllo sono stati analizzati tramite cromatografia size-exclusion che permette la separazione delle molecole organiche in base al loro peso molecolare.
L’analisi ha evidenziato spettri di assorbanza delle proteine a 280 nm diversi tra pellet derivati dall’omogenato di animali sensitizzati LT e di animali di controllo.
In seguito alla costruzione di una curva di taratura tramite iniezione nella colonna cromatografica di proteine a peso molecolare noto, sono stati evidenziati, in 7 campioni distinti, picchi di assorbanza corrispondenti a vari pesi molecolari (> 50 kDa a 5.42 min; circa 17,5 kDa a 7.89 min; circa 11 kDa a 9.18 min.) presenti esclusivamente nel pellet di animali sensitizzati LT e non in quello dei controlli. Sono state raccolte varie frazioni in un range di 5-12 minuti corrispondenti ai diversi picchi di assorbanza osservati e sono state iniettate in animali naïve precedentemente sottoposti ad una sessione di sensitizzazione. In una seconda sessione di sensitizzazione condotta un’ora dopo l’iniezione, gli animali trattati con la frazione di pellet ottenuto da animali sensitizzati LT corrispondente al peso molecolare di circa 11 kDa e indicata come frazione 8, hanno mostrato un potenziamento della risposta post brushing analoga a quello osservato dopo training LT, mentre le altre frazioni iniettate non hanno indotto effetto. Questi risultati hanno dunque evidenziato il coinvolgimento di proteine di circa 11kDa nell’instaurarsi dell’apprendimento LT. Questo dato è stato convalidato anche dall’analisi cromatografica a fase inversa effettuata sulla frazione 8 di animali sensitizzati LT, in cui sia gli spettri di assorbanza a 280 nm sia gli spettri di fluorescenza hanno indicato la presenza di tre picchi presenti nella frazione 8 degli animali LT e non nei controlli. Infine, l’analisi FTRI ha mostrato spettri nell’infrarosso tipici di proteine.
È attualmente in corso l’analisi proteomica per identificare la sequenza nucleotidica di queste proteine.