• tubercolosi
• Mycobacterium tuberculosis
• BCG
• vaccino

La tubercolosi nell’uomo, patologia causata da Mycobacterium tuberculosis, rimane la principale causa di morte tra le malattie infettive ad eziologia batterica, rappresentando ancora oggi un’emergenza sanitaria mondiale.
Attualmente, l’unico vaccino antitubercolare disponibile è un ceppo attenuato di Mycobacterium bovis, il bacillo di Calmette-Guèrin (BCG), il quale fornisce un’efficacia protettiva limitata e variabile poiché previene le forme disseminate dell’infezione nel bambino, ma non risulta altrettanto efficace nella prevenzione della tubercolosi polmonare dell’adulto, la forma più diffusa dell’infezione. Ad oggi gli approcci sperimentali per l’allestimento di vaccini antitubercolari alternativi comprendono vaccini a sub-unità, basati su miscele di antigeni proteici micobatterici, e vaccini vivi, che includono ceppi ricombinanti di BCG, capaci di esprimere antigeni immunodominanti del bacillo tubercolare, o ceppi attenuati di M. tuberculosis, knock-out per opportuni fattori di virulenza.
Oggetto del presente lavoro di tesi è stato l’allestimento e la caratterizzazione di due ceppi mutanti di M. tuberculosis, deleti per due cluster di geni localizzati nei loci cromosomici, codificanti per sistemi di secrezione ESX. I ceppi mutanti oggetto di studio sono stati allestiti mediante l’utilizzo di una strategia di inattivazione genica, basata sull’utilizzo di ricombinasi fagiche (Recombineering), che permette la delezione selettiva dei geni di interesse senza l’inserimento di marcatori di resistenza ad antibiotici. La caratterizzazione genotipica dei ceppi mutanti mediante tecniche di PCR, Southern blot e sequenziamento ha dimostrato l’effettiva delezione dei geni nei corrispondenti loci cromosomici.
L’analisi dei profili di secrezione proteica dei ceppi in studio mediante Western blot ha confermato che sia la delezione dei singoli loci cromosomici che la doppia delezione non alterano la secrezione di proteine immunodominanti, tra cui la proteina ESAT-6, codificata nel locus ESX-1 e secreta in ambiente extracellulare ad opera del sistema ESX-1. La secrezione di tale proteina rappresenta uno dei principali fattori responsabili della traslocazione del bacillo tubercolare dal fagosoma al citosol di macrofagi e cellule dendritiche, evento fondamentale per l’induzione di un’adeguata risposta protettiva sia di tipo TCD4+ che TCD8+. Allo scopo di valutare gli effetti della delezione prodotta sulla crescita del bacillo tubercolare in vitro, la cinetica di crescita dei tre ceppi mutanti è stata confrontata con quella del ceppo parentale in terreno liquido Middlebrook 7H9, mediante determinazione giornaliera della densità ottica delle rispettive colture. Le curve di crescita dei ceppi hanno mostrato un andamento paragonabile, suggerendo che le delezioni indotte non alterano la capacità replicativa di M. tuberculosis. L’analisi della capacità di replicazione intracellulare dei ceppi mutanti in due modelli sperimentali di infezione ex vivo (linee cellulari umane macrofagiche THP-1 ed epiteliali polmonari alveolari A549) ha permesso di valutare l’effetto delle delezioni dei loci in studio sulla virulenza di M. tuberculosis. I dati ottenuti hanno mostrato una riduzione della capacità replicativa intracellulare dei ceppi mutanti rispetto al ceppo parentale, potenzialmente predittiva di una attenuazione di tali ceppi anche in modelli in vivo.