• Depdc5 Gator1 Epilepsy Second hit Crispr

RIASSUNTO

Studi in letteratura riportano una mutazione eterozigote del gene Dep-domain containing 5 (Depdc5). Il gene Depdc5 codifica una proteina con il nome omonimo, che insieme a Nitrogen permease regulator 2-like protein (Nprl2) e Nitrogen permease regulator 3-like protein (Nprl3) costituiscono il complesso Gap Activity Toward Rags 1 (Gator 1). Gator1 è un regolatore negativo del pathway di mTOR. La mutazione di Depdc5 è stata osservata in soggetti affetti da epilessia focale ed in seguito riscontrata anche in altre forme di epilessia, come epilessia del lobo temporale (FTLE), epilessia autosomica dominante notturna frontale (ADNFLE), displasia corticale focale (FCD).
I meccanismi alla base dell’epilessia e cosa succede a livello del sistema nervoso non sono ancora stati chiariti. Diversi studi riguardanti malattie causate da mutazioni nel pathway di mTOR, chiamate “mToropathies”, ipotizzano l’insorgenza di una seconda mutazione. In Depdc5 durante lo sviluppo o nel corso della vita, si potrebbe creare una seconda mutazione sull’altro allele fondamentale per la manifestazione dell’epilessia. Quando si verifica un deficit di amminoacidi, Gator che regola negativamente mTOR complex 1 (mTORC1), una subunità catalitica del complesso mechanistic target of rapamycin (mTOR) ,non svolge la sua funzione e di conseguenza mTOR è iperattivato questo sembra conduca all’epilessia.
Al fine di comprendere il coinvolgimento di Depdc5 nelle varie forme di epilessia, nel presente studio è stata studiata la funzione del gene nello sviluppo neuronale, usando cellule staminali embrionali di topo knocked-out per il gene Depdc5 mediante la tecnologia Crispr/Cas9. Tre diversi cloni mutati in Depdc5 (KO) e tre cloni non-mutati (wild-type o controlli) sono stati differenziati in neuroni corticali e analizzati a diversi time-points per l’espressione di Depdc5, di progenitori neuronali Emx2,Mash1 e Tbr1 e Vgat,Vglut e Gfap e di fattori di migrazione neuronale (Rac1,Rap1,RND2,SEM3A,Slit1). Sono stati analizzati anche i livelli di fosforilazione della proteina S6, marcatore dell’attività di mTOR, e della proteina Akt, coinvolta nel pathway di mTOR.
L’analisi mediante qPCR ha confermato una quasi totale scomparsa dell’espressione di Depdc5 nelle cellule mutate. I fattori di trascrizione dei progenitori neurali delle prime fasi di differenziazione ed alcuni marcatori della fase tardiva analizzati sono inclini a ridursi nei cloni mutati rispetto ai controlli.
Dall’analisi al Western blotting si osserva un aumento della fosforilazione di S6 nei cloni mutati rispetto ai controlli, in entrambe cellule differenziate e non.
Inoltre i cloni mutati rispetto ai controlli evidenziano difficoltà nella migrazione, e l’analisi dei fattori di migrazioni Rac1,Rap1,RND2,SEM3A,Slit1 tramite qPCR mostra una loro ridotta espressione nelle cellule mutate
Pertanto, tale studio potrebbe suggerire che una mutazione nel gene Depdc5, che causa una diminuzione dell’espressione della proteina, causi un’iperattivazione di mTOR. A questo va associata un’alterata funzionalità neuronale suggerita da iperfosforilazione di p-s6 e le difficoltà migratorie mostrate sia dall’immunofluorescenza sia dalla riduzione dei fattori neuronali responsabili della migrazione. Questi risultati preliminari necessitano tuttavia ulteriori ricerche ed approfondimenti.