• diabete
• potenziale di membrana mitocondriale

Introduzione:
L’adeguata funzionalità cellulare richiede il mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale, sostenuto dalla catena di trasporto degli elettroni. Stress ossidativo e disfunzione mitocondriale sono ritenuti d’importanza patogenetica nello sviluppo di numerose malattie cronico-degenerative, inclusa la malattia diabetica e le sue complicanze [Nishikawa et al.]. Il potenziale di membrana mit. può essere misurato mediante citometria a flusso utilizzando coloranti cationici lipofilici, come il JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide). Questo fluorocromo si localizza a livello della membrana mitocondriale sotto forma di aggregati che danno fluorescenza rossa (FL2), mentre resta in forma monomerica (fluorescenza verde, FL1) a livello citoplasmatico, quando ci sia una caduta del potenziale di membrana mit. Si utilizzano agenti disaccoppianti, per esempio il carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), come controllo positivo per verificare il collasso del potenziale di membrana mit. Per la rilevazione qualitativa della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), prodotti dall’attività della NADPH ossidasi, è possibile usare una sonda non fluorescente, la Dihydrorhodamine-123 (DHR). La DHR, in seguito all’attivazione da parte dei ROS, viene convertita in rhodamina-123 la quale si localizza preferenzialmente all’interno dei mitocondri, ed esibisce fluorescenza verde. La misurazione della fluorescenza è una valutazione indiretta del metabolismo ossidativo cellulare.
Scopo della tesi:
Obiettivi della nostra ricerca sono stati: 1) misurare mediante il fluorocromo JC-1 il pot.di mem.mitoc di leucociti polimorfonucleati da pazienti diabetici tipo 1, loro fratelli non diabetici e soggetti di controllo; 2) misurazione della produzione di ROS nei tre gruppi di pazienti suddetti mediante la sonda DHR; 3) applicazione della metodica per la misurazione delpotenziale di membrana mitocondriale in citometria a flusso a colture cellulari in monostrato.

Materiali e metodi:
Metodica di misurazione del potenzilae di membrana mit.su cellule circolanti ex vivo:
100 µl di sangue intero di 20 pazienti con diabete di tipo 1 (12 donne), di 20 loro fratelli di primo grado (12 donne) e di 25 soggetti sani di controllo (16 donne) sono stati incubati con 20 µmol/l di JC-1 per 15 minuti a 37°C in presenza o in assenza di 100 µmol/l di CCCP. Dopo lisi eritrocitaria (3 ml di soluzione lisante NH4CL 155mmol/L, KHCO3 10mmol/L), i neutrofili sono stati analizzati mediante FACScalibur (BD Biosciences, Milano, e programma di analisi dei dati CELL Quest) con l’acquisizione di 10000 cellule per campione attraverso il gate dei granulociti. Per misurare la produzione di ROS utilizzando la sonda DHR, 100µl di sangue intero sono stati incubati con 5µmol/l di DHR per 15 minuti a 37°C in presenza o in assenza di 1µmol/l di Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), utilizzato come controllo positivo. Abbiamo poi indagato se, incubando i leucociti umani con concentrazioni crescenti di glucosio e/o insulina, si riscontravano variazioni del pot.di membrana mit.: 100 µl di sangue prelevato in EDTA sono stati incubati a 37°C per un tempo compreso tra i 15 minuti e le 24 ore con concentrazioni di glucosio che variavano tra 5 e 44 mmol/l e/o di insulina umana in concentrazioni variabili tra 10 e 192 µU/mL. Al termine dell’incubazione, si è proceduto alla misurazione citofluorimetrica del pot. di membrana mit.leucocitario mediante JC-1, con o senza CCCP.

Metodica di misurazione del pot. di membrana mit.su culture cellulari:
Sono state utilizzate colture cellulari di fibroblasti, INS-1E e HUVEC. I fibroblasti sono stati isolati dalla cute di donatori. La cute, una volta raccolta, è stata tritata e digerita per due ore in una soluzione allo 0,20% di collagenasi I sciolta in Dulbecco’s modified Eagle’s medium privo di siero, a 37°C. La linea clonale di cellule β, INS-1E, è stata coltivata in atmosfera umidificata al 5% di CO2, in terreno completo composto da RPMI 1640 arricchito con il 10% di siero fetale bovino, 1mmol/l di sodio piruvato, 50µmol/l di 2-mercaptoetanolo, 2mmol/l di glutamina, 10mmol/l di Hepes, 100 U/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina, e piastrate ad una densità di 4 x 104cellule /cm2 in fiasca da 75 cm2.
Le HUVEC sono state estratte da cordone ombelicale e il terreno di coltura preparato utilizzando 400 ml di M199 (Sigma, Milano) con aggiunta di: 2,5 ml di soluzione di penicillina/streptomicina 5000 UI/ml, 10000 µg/ml (concentrazioni finali 25 UI/ml, 50 µg/ml) (Sigma), 5 ml di glutammina 200 mmol/l (Sigma) (2 mmol/l finale), 5 ml Hepes 1M (Sigma) (10 mmol/l finale), 1,2 ml di eparina sodica 2100 UI/ml (5 UI/ml finale) (Roche), 100 ml di siero fetale bovino (FCS) scomplementato a 56 C per 1 ora (Sigma) (20% finale) e 5 ml di fattore di crescita ottenuto da retina bovina (RDGF, 1% finale).

Analisi statistica
L’analisi statistica è stata eseguita mediante il test t di Student, l’analisi della varianza e la regressione lineare semplice e multipla (software program Aabel 3, Gigawiz Ltd. Co). I dati sono espressi come media ± DS.

Risultati:
Lo studio eseguito sui leucociti umani circolanti ha evidenziato che il valore del potenziale di membrana mit.nei pazienti con diabete tipo 1 (p<0.01) e nei loro fratelli non diabetici (p<0.05) era elevato in confronto a quello riscontrato nei soggetti di controllo. La glicemia a digiuno era l’unica variabile biologica che correlava con il potenz.di membrana mit. Dal punto di vista clinico, i tre gruppi di soggetti non differivano per età, sesso, o pressione arteriosa media. I fratelli dei diabetici tipo 1 avevano un BMI lievemente superiore rispetto ai controlli. Dal punto di vista biochimico, i pazienti con diabete tipo 1 avevano livelli superiori alla norma di glicemia e HbA1c; i loro fratelli differivano dai controlli per glicemia a digiuno lievemente maggiore (p<0.05), HbA1c (p<0.01) e HOMA-IS (homeostasis model assessment of insulin sensitivity 0.48+/-0.20 vs 0.70+/-0.43, p<0.05) minori. L'intensità della fluorescenza emessa dalla DHR nei leucociti in condizioni basali era sovrapponibile nei tre gruppi di soggetti studiati.
I neutrofili circolanti, incubati in vitro con glucosio e/o insulina, non hanno mostrato variazioni statisticamente significative del pot.di membrana mitocondriale. L’insulina potrebbe avere un’azione stimolante sul pot.di mem.mit.(r = 0.2, p = 0.085 alla regressione lineare), ma probabilmente occorrono tempi più lunghi d’incubazione per raggiungere la significatività statistica. Quando però l’incubazione a 37°C è stata prolungata fino a 24 ore, abbiamo assistito alla progressiva depolarizzazione mitocondriale, presumibilmente in relazione all’esaurimento delle scorte metaboliche (glucosio) da parte della preponderante massa eritrocitaria. D’altra parte, come dimostrato da Beitland et al, i risultati che si ottengono studiando i polimorfonucleati in vitro differiscono da quelli riscontrati in vivo a causa di numerosi fattori (interazioni cellulari e meccanismi regolatori) che non sono riproducibili in vitro.
L’esecuzione della lettura citofluorimetrica del pot. di mem. mit su cellule in coltura ha richiesto alcuni accorgimenti tecnici per evitare artefatti legati alle proprietà adesive di tali cellule e, quindi, alla presenza di due popolazioni di cellule, singoletti e doppietti. Il citofluorimetro però, essendo uno strumento dotato di grande versatilità, permette di eseguire letture su gate mirati in modo da misurare solo l’emissione di fluorescenza dei singoletti e non dei doppietti (falsamente più alta). Per quanto riguarda i fibroblasti, l’incubazione con il glucosio non ha modificato in maniera specifica il pot di membrana mit.
Per quanto riguarda le INS 1-E, la massima stimolazione, e quindi iperpolarizzazione, è stata osservata con una concentrazione di glucosio pari a 7,5 mmol/l. Concentrazioni superiori non hanno incrementato ulteriormente il pot. di mem. mit.
Infine, abbiamo applicato la metodica alle cellule endoteliali (HUVEC), riuscendo a leggere la fluorescenza del 93,2% delle cellule presenti nel campione.

Conclusioni:
Nelle famiglie di pazienti diabetici tipo 1 le oscillazioni del potenziale mitocondriale indotte dai ROS sembrano essere sincronizzate verso uno stato di iperpolarizzazione. L’associazione positiva fra il potenziale mitocondriale e la glicemia, in un range che va dallo stato normo-glicemico a quello dis-glicemico, suggerisce che l’iperglicemia aumenti la metabolizzazione del glucosio e favorisca così l’iperpolarizzazione della membrana mitocondriale. Nel nostro studio, il divario tra i risultati ex vivo (leucociti di pazienti diabetici) ed in vitro (leucociti umani incubati con concentrazioni crescenti di glucosio e/o insulina), è spiegabile considerando che in vivo intervengono interazioni ormonali e cellulari che non sono riproducibili in vitro, ma incidono sui parametri bioenergetici cellulari. La metodica citofluorimetrica permette di misurare il potenziale di membrana mitocondriale anche di cellule dotate di grande adesività, come i fibroblasti, purchè si eseguano dei gate mirati sui soli singoletti. La metodica, applicata alle INS-1E, fornisce inoltre un modello sperimentale per lo studio della secrezione autocrina di insulina legata alla stimolazione con glucosio (GSIS). Infine, le Huvec, pur essendo cellule molto delicate, si mantengono vitali per oltre il 93%.

Sviluppi futuri:
Intendiamo proseguire le misurazioni del potenziale di membrana mitocondriale su cellule HUVEC isolate e sottoposte a incubazione con concentrazioni crescenti di glucosio per periodi di tempo predefiniti in modo da ottenere informazioni sull’effettivo instaurarsi di un meccanismo di memoria metabolica.