• elettroforesi bidimensionale
• Heat Shock Protein
• Hediste diversicolor
• nanoparticelle
• Rt-PCR
• stress ossidativo
• Superossido dismutasi

Negli ultimi anni è cresciuto l’interesse per lo studio delle nanoparticelle (materiali con caratteristiche morfologiche al livello di nanoscala, compresi tra 0 e 100 nanometri) che possono essere naturalmente presenti nell’ambiente oppure di origine antropica. Fra queste le particelle “non intenzionali” ultrafini che sono associate al rilascio di gas veicolare. Inoltre esistono varie classi di nanoparticelle e tra le più conosciute vi sono i fullereni ovvero gli allotropi molecolari del carbonio. La loro distribuzione nell’ambiente acquatico (sia dolce che marino) è particolarmente studiata, in quanto questo comparto risulta essere il deposito finale “sink” delle nanoparticelle, portate dagli eventi atmosferici naturali come piogge o venti e dalle acque reflue di origine domestica o industriale. Le varie specie di nanoparticelle possono aggregarsi o meno fra di loro, formando dei colloidi che possono restare in sospensione oppure precipitare. Ciò contribuisce a rendere il sedimento stesso e gli organismi bentonici che vi vivono, i principali “sink” (depositi) di nanoparticelle. Per questo motivo i policheti possono essere utilizzati come organismi test per la valutazione ambientale. Il ruolo dei policheti risulta interessante riguardo al possibile trasferimento dei contaminanti (tra cui le nanoparticelle) ai livelli trofici superiori, dato che questi organismi rappresentano il cibo di un elevato numero di pesci che vivono a contatto con il sedimento. Infatti diverse specie di policheti possono accumulare all’interno del loro corpo composti chimici (organici o inorganici) così da divenire dei veri e propri “biomonitor”
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di avviare uno studio atto a identificare eventuali marcatori molecolari che correlino l’espressione genica di questi organismi con la loro esposizione alle nanoparticelle di tipo Single Walled Carbon Nano Hornes (SWCNHs) , mediante un approccio proteomico comparativo. L’organismo che è stato analizzato è Hediste diversicolor, una specie di polichete infaunale appartenente alla famiglia dei Nereidi, i cui campioni sono stati gentilmente forniti dalla Dott.ssa Nesto dell’ Istituto di Scienze Marine, CNR-ISMAR di Venezia.
Nell’analisi proteomica è rappresentativa la tecnica dall’elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE) che consente di separare e identificare proteine con un preciso punto isoelettrico e massa molecolare approssimata. In ogni analisi proteomica è necessario avere un protocollo di estrazione delle proteine e una separazione con elettroforesi bidimensionale ottimizzata per il campione oggetto di studio. Per tale motivo la prima fase del lavoro di tesi ha avuto come scopo quello di ottimizzare un protocollo d’estrazione proteica e utilizzando il protocollo messo a punto sono state successivamente ricavate le mappe proteiche di campioni di H. diversicolor allevati in condizioni di controllo o esposti a nanoparticelle SWCNHs.
Le mappe sono state analizzate mediante un software dedicato che ha permesso di identificare alcuni spot diversamente espressi nelle due situazioni di crescita. Tali macchie sono state “excise” dal gel e soggette ad analisi di spettrometria di massa evidenziando la possibile implicazione di due “Heat shock proteins” nella risposta di H. diversicolor alle SWCNHs. Per verificare questa ipotesi sono stati designati i primers di queste proteine usando i peptidi identificati nella macchia dall’analisi di massa ed è stata applicata la tecnica dell’ RT-PCR, capace di rilevare la presenza dei trascritti delle “Heat Shock Proteins” e caratterizzare l’espressione genica.
Dato che le nanoparticelle che entrano nelle cellule possono provocare danni cellulari e sovra produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) ed i ROS inducono “Heat shock proteins” la seconda parte del lavoro di tesi si è focalizzata sulla caratterizzazione dell’attività della superossido dismutasi (SOD), enzima chiave nello “scavenging” dei ROS. L’attività della SOD è stata determinata sia con un’analisi spettrofotometrica classica, sia mediante “in-gel activity-staining” ovvero separazione elettroforetica nativa bidimensionale su gel di poliacrilamide.