• cancro al colon retto
• microRNA
• CD86

Il cancro al colon retto (CRC) è la terza forma più comune di tumore nell’uomo e la seconda causa di morte per cancro nel mondo Occidentale. L’insorgenza di tale malattia può aumentare a causa di fattori ambientali (fumo, dieta sbilanciata, verdura, pesce, abuso di alcol e inattività fisica), di malattie correlate come coliti o infiammazioni croniche ( morbo di Crohn). La de-regolazione genica è uno dei meccanismi chiave attraverso cui le cellule possono progredire allo sviluppo del tumore. Recentemente sono stati descritti nuovi meccanismi che regolano l’espressione di geni implicati nello sviluppo del cancro. Tra questi la regolazione post-trascrizione attraverso i microRNA (miRNA) è uno dei più interessanti e potenti meccanismi che mantengono e gestiscono la differenziazione cellulare. I miRNA sono piccole molecole di RNA a singolo filamento di circa 22 nucleotidi. Queste molecole esplicano la loro funzione appaiandosi con la regione 3’UTR di mRNA target determinandone il taglio o il blocco temporaneo della traduzione. E’ stato ipotizzato che la presenza di SNPs all’interno della regione 3’UTR possa alterare il legame tra i miRNA ed il loro target, influenzando la regolazione dei geni e il rischio individuale di sviluppare cancro. In uno studio precedente sono state selezionate le regioni 3’UTR di 129 geni implicati nel cancro colon- rettale e sono stati identificati i siti di legame per i miRNA utilizzando algoritmi specializzati. All’interno di tali siti, 51 polimorfismi sono stati valutati per la loro capacità di influenzare il legame tra i microRNA e il suo target, calcolando la variazione di energia libera di Gibbs tra i due alleli di ogni SNPs. Tramite uno studio di associazione di tipo caso-controllo sono risultati statisticamente associati al rischio di cancro colon rettale l’allele variante di CD86 e di INSR ( rispettivamente rs17281995 e rs 10511690 ). Lo scopo della presente tesi è quello di valutare l’effetto biologico dei due SNPs target dei miRNA presenti nella regione 3’UTR di CD86 ed INSR ed il legame dei miRNA stessi con i target polimorfici mediante l’uso del reporter standard luciferasi/renilla. L’estremità 3’UTR dei geni (sia quella contente l’allele wild type che l’allele variante nel sito target polimorfico) viene clonata a valle del gene della luciferasi. Questi plasmidi ricombinanti sono trasfettati con il miRNA di interesse in cellule ospiti (HeLa) insieme ad un plasmide contenete il gene codificante la renilla. Dopo la trasfezione viene eseguita la lisi cellulare mediante Passive Lysis Buffer (PLB) e di seguito la lettura della luminescenza della luciferasi e della renilla. La luminescenza della renilla è utilizzata come valore standard da rapportare a quello della luciferasi per rilevare se il miRNA abbia legato o meno il target. Se il miRNA preso in considerazione ha come target il 3’UTR selezionato si avrà diminuzione del rapporto tra la luminescenza della luciferasi e della renilla. I dati ottenuti saranno sottoposti ad opportuna analisi statistica per valutare l’effetto biologico dei polimorfismi su un miRNA-target.