• sistema serotoninergico
• ricombinazione omologa
• ricombinasi Cre
• Pet1
• cromosomi batterici artificiali (BAC)
• topo
• transgenesi

Da oltre venti anni, l’introduzione di geni nella linea germinale di topo, nota come transgenesi, ha contribuito in maniera fondamentale allo studio dell’espressione e della funzione genica. Il successivo avvento della transgenesi binaria e l’uso della ricombinasi Cre hanno permesso la generazione del “knockout” condizionale tempo e tessuto specifico di numerosi geni coinvolti nel controllo dello sviluppo embrionale. Inoltre, la disponibilità di linee transgeniche in grado di esprimere geni “reporter” in maniera inducibile ha offerto la possibilità per un approccio in vivo dello studio dell’espressione genica. Recentemente, lo sviluppo di metodologie basate sulla ricombinazione omologa in E. coli per ingegnerizzare i cromosomi batterici artificiali (BAC) ha permesso di generare topi transgenici BAC. Grazie alla tecnologia BAC è stato possibile abolire l’attivazione trascrizionale ectopica del transgene (“leaking”), tipica della transgenesi convenzionale. Questa strategia offre una straordinaria opportunità per studiare lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC) sia dal punto di vista morfologico che molecolare.
Il sistema serotoninergico è coinvolto nella regolazione di una grande varietà di processi fisiologici e comportamentali come, ad esempio, l’apprendimento, la memoria, il sonno, la regolazione del comportamento alimentare etc.. Evidenze sperimentali hanno mostrato che la serotonina (5-HT) è coinvolta nello sviluppo del SNC. I neuroni serotoninergici originano nella regione ventrale del rombencefalo, dove è presente una combinazione di specifici fattori di trascrizione e molecole di secrezione, e si organizzano in nuclei distinti denominati nuclei del raphe. Tra questi, il gene Pet1 risulta essere particolarmente interessante in quanto si esprime selettivamente ed a partire da stadi molto precoci dello sviluppo embrionale nei neuroni serotoninergici
Durante il mio lavoro di tesi ho ingegnerizzato un BAC contenente la regione genomica di Pet1 allo scopo di generare una linea transgenica di topo Pet1/Cre, in cui la regione codificante della ricombinasi Cre risulta essere sotto il controllo trascrizionale di Pet1. La linea Pet1/Cre potrà essere incrociata con linee transgeniche in grado di esprimere geni “reporter” in maniera inducibile. Questo mi permetterà di studiare lo sviluppo, durante l’embriogenesi, del sistema serotoninergico e la formazione delle sue numerose proiezioni verso tutto il SNC.
Inizialmente ho effettuato uno “screening in silico” per individuare un BAC che contenesse la regione genomica di Pet1. Ho individuato un clone contenente circa 210 kb in cui la regione codificante di Pet1 si trova rispettivamente a 170 e 40 kb dalle estremità 5’ e 3’. Questo tipo di organizzazione genica offre la garanzia che tutti gli elementi responsabili per il controllo trascrizionale del gene Pet1 siano presenti nel BAC prescelto. In parallelo, impiegando tecniche di “overlapping PCR” e di clonaggio classico, ho preparato un costrutto di cDNA per sostituire la regione codificante di Pet1 con quella della ricombinasi Cre mediante la ricombinazione omologa nel BAC. Tale costrutto, oltre al cDNA per la Cre, presenta due porzioni laterali di omologia con le sequenze genomiche fiancheggianti il gene Pet1, necessarie per mediare la ricombinazione omologa. Infine, ho aggiunto il cDNA di un gene in grado di conferire resistenza alla kanamicina così da poter individuare i cloni eventualmente ricombinanti. Per la ricombinazione omologa ho usato il ceppo di E. coli DY380 derivante da quello DH10B in quanto presenta un sistema di ricombinazione temperatura inducibile molto efficace. Ho ottenuto numerosi cloni resistenti alla kanamicina e di questi ne ho analizzati 30 mediante esperimenti sia di PCR che di “Southern blot” allo scopo di individuare il sito di inserzione del costrutto. Tra questi ho individuato 10 cloni positivi che a breve saranno impiegati per la generazione della linea transgenica Pet1/Cre mediante iniezione del DNA del clone BAC in macronuclei di topo.

For over twenty years, the introduction of genes in the germinal line of mouse, known as transgenesis, has greatly contributed to the study of gene expression and function. The following introduction of binary systems and the use of Cre recombinase have permitted the generation of conditional time and tissue specific “knockouts” of many genes involved in the control of embryogenesis. Furthermore, the availability of transgenic lines able to express “reporter” gene in an inducible way, has offered the possibility for an in vivo approach for the study of gene expression. Recently, the development of methods for engineering bacterial artificial chromosomes (BAC) based on homologous recombination in E.coli has permitted the generation of BAC transgenic mice. By BAC technology it has been possible to abolish the ectopic transcriptional activation of the transgene (“leaking”), typical in conventional transgenesis. This strategy offers an extraordinary opportunity for studying the development of central nervous system (CNS), from both the morphological and molecular points of view.
The serotoninergic system is involved in the regulation of a great variety of physiological and behavioural processes as, for example, learning, memory, sleep, regulation of alimentary behaviour etc.. Experimental evidences have demonstrated that serotonin is involved in the development of CNS. The serotonergic neurons originate in the ventral region of hindbrain, where present a combination of specific transcriptional factors and secrete molecules, and organize themselves in distinct nuclei called raphe nuclei. Among these, the gene Pet1 is particularly important because expresses itself in a selective manner and beginning from early stages of embryo development in serotoninergic neurons.
During my work of thesis I have engineered a BAC that contains the genomic region of Pet1 for the generation of the mouse transgenic line Pet1/Cre, where the coding region of Cre recombinase is transcriptionally controlled by Pet1. The line Pet1/Cre will be crossed with transgenic lines able to express “reporter” genes in an inducible way. This will permits the studying of the development, during embryogenesis, of the serotoninergic system and the formation of its numerous projections toward all the CNS.
At first I have performed an “in silico screening” to recognize the BAC containing the genomic region of Pet1. I have identified a clone containing about 210 kb, in which coding region of Pet1 is placed at 170 and 40 kb from the 5’ and 3’ ends, respectively. This type of gene organization makes sure that all elements responsible for the transcriptional control of Pet1 are present in the chosen BAC. In parallel, using the “overlapping PCR” and classical cloning techniques I have prepared a cDNA construct to replace the coding region of Pet1 with the one of Cre recombinase by homologous recombination in BAC. This construct, besides the Cre cDNA, presents two lateral portions of homology with genomic sequences flanking Pet1, necessary for homologous recombination. At last, I have added the cDNA for a gene capable to confer kanamicin resistance to identify the recombinant clones. For homologous recombination I have used the E.coli DY380 strain of, that derives from the DH10B strain and presents a very efficient inducible-temperature recombination system. I have found numerous kanamicin resistant clones and I have analysed 30 of these by PCR and “Southern blot” techniques in order to identify the insertion site of the construct. Among these I have identified 10 positive clones that soon will be used early for the generation of Pet1/Cre transgenic line by injection of the BAC clone DNA in the macronucleus of mice.