• terapia genica
• Saccharomyces cerevisiae
• virus adeno-associato
• espressione di proteine adenovirali
• estrazione e caratterizzazione del genoma di AAV d

Il mio lavoro di tesi si inserisce in un progetto di ricerca che ha come scopo quello di capire se il lievito Saccharomyces cerevisiae possa funzionare come organismo modello ospite per la produzione di vettori derivati dal virus adeno associato (AAV). L'AAV è un virus non patogeno di dimensioni di 18-30 nm con un genoma a DNA a singolo filamento di 4,7 Kb.
La denominazione "adeno-associato" deriva dal fatto che esso non e in grado di replicarsi autonomamente, ma necessita di un altro virus, detto "helper", che in genere è un adenovirus o un herpes virus. Nel nostro laboratorio è stato recentemente dimostrato che il DNA di AAV si replica in lievito e che questo organismo è in grado di sostenere la formazione di DNA di AAV a singolo filamento direttamente da un plasmide episomico contenente le sequenze in cis necessarie per la replicazione (ITR), qualora venga espressa la proteina regolatoria di AAV Rep68/78. E'stato inoltre osservato in laboratorio che in presenza delle proteine adenovirali E4orf6 ed E1b55k si ha un forte aumento nella produzione di DNA di AAV a singolo filamento (ssDNA).
Cio suggerisce che, come nelle cellule umane, anche in lievito E4orf6 ed E1b55k hanno un ruolo nella formazione di ssDNA. Da studi condotti sulle cellule umane è noto che queste proteine inducono la degradazione di proteine coinvolte nella riparazione del DNA, tra cui la proteina Mre11, del complesso MRN, promuovendo la trasduzione di AAV.
Lo scopo del lavoro di tesi è quello di caratterizzare il fenotipo di S. cerevisiae esprimente E4orf6 e E1b55k; in particolare vedere se, come nelle cellule umane, le dette proteine promuovono la degradazione della proteina Mre11; altro scopo è studiare la formazione del ssDNA di AAV nel ceppo di S. cerevisiae mre11∆. Anche nel lievito S.cerevisiae, la proteina omologa di Mre11 fa parte di un complesso detto MRX implicato nella riparazione dei danni a doppio filamento di DNA (DSBs). Ceppi mutanti per queste proteine risultano essere piu sensibili a radiazioni ionizzanti e ad agenti alchilanti come il metilmetansulfonato (MMS) e presentano alterazioni nella lunghezza dei telomeri.
Per capire se E4orf6-E1b55k, espresse nel nostro ceppo di lievito (RSY12), promuovano la degradazione di Mre11, abbiamo effettuato esperimenti di Western Blot.
Per caratterizzare il fenotipo determinato dall'espressione delle proteine adenovirali in lievito, abbiamo studiato se queste proteine alterano la sensibilita all'MMS e la lunghezza dei telomeri.
I risultati ottenuti indicano che il complesso E4orf6-E1b55k promuove la degradazione di Mre11, determinando un fenotipo simile a quello del ceppo mre11∆, caratterizzato da maggiore sensibilità all' MMS ed un accorciamento piu marcato dei telomeri.
Il passo successivo e stato quello di andare a produrre il single strand di AAV nel ceppo di lievito mre11∆. Abbiamo quindi espresso in questo ceppo un plasmide episomico contenente le sequenze in cis necessarie per la replicazione (ITR) e la proteina regolatoria di AAV Rep68/78 valutando la produzione di single strand virale.
L'analisi del processamento del plasmide pAAVpokURA mediante Southern blot nel ceppo mre11∆ mostra che, in assenza di tale proteina, non si ha la formazione del ssDNA, contrariamente a quanto osservato nel ceppo wild type.
L'assenza di Mre11 determina quindi un processamento diverso del plasmide che sfavorisce la formazione di ssDNA.