• zebrafish
• miR-218
• transgenesi

I miRNA sono piccole molecole della grandezza di 20-22 nt trascritti soprattutto nelle regione introniche di geni, ma anche in regioni intergeniche. Una volta processati nel nucleo e successivamente nel citoplasma, la loro azione viene esplicata regolando negativamente l’espressione dei geni su cui agiscono.
MiR-218, su cui verte questo lavoro di tesi, si trova nelle regioni introniche dei geni di slit2 e slit3.
Il microRNA in questione è implicato nello sviluppo cardiaco in organismi quali Drosophila, topo ed anche in zebrafish. In quest’ultimo sistema modello un aumento dell’espressione del miR-218 va a determinare gravi difetti cardiaci (edema pericardico, looping non completo del cuore). Dati precedentemente ottenuti nel nostro laboratorio dimostrano che miR-218 è controllato da Tbx5, un fattore di trascrizione importante per lo sviluppo cardiaco la cui alterazione , responsabile nell’uomo della sindrome di Holt-Oram, determina l’alterazione dell’espressione di centinaia di geni. L’importanza di miR-218 come mediatore dell’azione di Tbx5 è dimostrato dall’osservazione che alterazioni fenotipiche causate in zebrafish dall’overespressione di TBX5 possono essere parzialmente compensate dalla riduzione del miR-218.
Lo scopo di questa tesi è stato di analizzare in maggiore dettaglio il ruolo del miR-218 nella morfogenesi cardiaca di zebrafish
Il problema che si riscontra nello studio dei miRNA in zebrafish, consiste nella impossibilità di valutare con precisione i loro effetti, sia dal punto di vista temporale, che spaziale.
Questo problema può essere almeno in parte risolto costruendo linee di pesci transgeniche in grado di modulare spazialmente e temporalmente il gene/microRNA d’interesse, attraverso il sistema Cre-Lox.
La preparazione dei costrutti avviene nei batteri E.coli che permettono di ottenerne una alta quantità di copie, oltre ad essere di più facile manipolazione. La tecnica di clonaggio utilizzata è stata quella del “gateway technology” oltre che il clonaggio classico.
Le due linee preparate sono:

•Cmlc2-Cre: in cui la ricombinasi si trova sotto il promotore della miosina cardiaca Cmlc2 (controllo spaziale). La ricombinasi Cre è fusa con il recettore mutato degli estrogeni; una volta tradotta, viene traslocata nel nucleo solo attraverso l’utilizzo del farmaco tamoxifen (controllo temporale).
•Ubi-eGFP-RFP-miR218:in cui, tra i siti Lox, riconosciuti e tagliati dalla ricombinasi, si trova tra la sequenza genica della GFP. Questa viene prodotta , sotto il controllo del promotore dell’ubiquitina, e, in assenza di Cre, risulta visibile in quanto emette una fluorescenza verde. A valle della GFP, esterna ai siti lox, si trova la sequenza della RFP contenente , un introne al cui interno è posizionato il miR-218.
Solo nel cuore (grazie alla Cmlc2) ed al tempo di sviluppo da noi desiderato (attraverso l’utilizzo di tamoxifen) la ricombinasi verrà espressa, i siti lox escissi ed espressa la RFP che, con la fluorescenza rossa, ci indicherà l’effettivo taglio. Insieme a questa sarà anche espresso il miR218,.
Grazie alla presenza del promotore ubiquitina che è un promotore promotore forte ci sarà una overespressione del miR218.

In alternativa è stata preparata una ulteriore linea, per valutare la downregulation del microRNA.
La linea Cmlc2-Cre viene mantenuta; la seconda linea viene costruita con le seguenti componenti:

•Ubi-eGFP-RFP-sponge: la sponge è una sequenza di miRNA binding site in cui il microRNA si lega sequestrandolo alla propria funzione. Questa sequenza viene posizionata al 3’UTR della RFP.