• p53
• MDM2
• cellule staminali mesenchimali
• processo di osteogenesi in vitro

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule stromali multipotenti, capaci di differenziarsi in diversi tipi cellulari, tra cui condrociti ed osteoblasti, e capaci di generare tessuti come ossa, cartilagini, muscoli e tessuto adiposo. Queste cellule rappresentano quindi una grande riserva per il processo osteogenico, mediante il quale si originano nuovi osteoblasti. Gli osteoblasti, svolgono un'azione importante a livello del rimodellamento, portando a rigenerazione della matrice ossea. In particolare, queste cellule, una volta avvenuto il differenziamento a partire dalle MSC, si attivano e secernono proteine specifiche della matrice come collagene, osteocalcina (OC) e fosfatasi alcalina (ALP).
Il differenziamento di osteoblasti è un processo molto complesso, regolato da numerosi fattori di trascrizione come Runx2 e Osterix (Osx), e da fattori di crescita, quali Wnt e la famiglia delle proteine morfogenetiche ossee (BMP).
Il processo di osteogenesi, inoltre, è regolato dalla proteina oncosoppressiva p53 che, inibendo i fattori di trascrizione Runx2 e Osx, rallenta il differenziamento delle MSC a osteoblasti. Il regolatore negativo di p53, MDM2 (Murine double minute 2) invece, è stato dimostrato agire da stimolo per il processo di osteogenesi, portando ad un aumento dell'osteocalcina e ad una maggior attivazione di Runx2. Tuttavia, i meccanismi che regolano l'asse p53/MDM2 nella differenziazione degli osteoblasti restano ancora da chiarire, anche considerando che MDM2 possiede numerose attività indipendenti dalla proteina p53 e che può interagire con altre proteine coinvolte nei processi di vita/morte/differenziamento cellulare.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare gli effetti della modulazione del legame MDM2/p53 sul differenziamento delle MSC in osteoblasti, utilizzando inibitori del complesso p53/MDM2. In particolare, sono stati valutati gli effetti dell'inibitore irreversibile EB148, sintetizzato presso il laboratorio di ricerca del Professore Da Settimo (Università di Pisa), su cellule staminali mesenchimali. Il composto è stato analizzato esaminando in parallelo, gli effetti dell'inibitore reversibile EB54 e dell'inibitore di riferimento Nutlina-3 (NUT-3). Sono state svolte prove sulla vitalità cellulare, sulla mineralizzazione cellulare (come indice di differenziamento a osteoblasti) e valutazioni sull'espressione di marker di osteogenesi (Runx2, Osterix, Osteocalcina, ALP), attraverso Real-Time RT-PCR.
La prima analisi svolta per verificare la capacità dei composti EB148, EB54, NUT-3 di influenzare la proliferazione e la vitalità cellulare delle MSC, ha evidenziato che i composti EB54 e NUT-3, portano ad una riduzione significativa della proliferazione delle MSC quando testati ad alte concentrazioni. Al contrario, il composto EB148 non ha evidenziato nessuna alterazione significativa della vitalità cellulare.
Successivamente, i composti sono stati testati a varie concentrazioni ed esaminati al settimo, quattordicesimo, ventunesimo giorno di trattamento, per verificare gli effetti sul differenziamento delle MSC in osteoblasti. I risultati ottenuti hanno evidenziato una differente attività pro-osteogenica dei composti EB148 ed EB54. Infatti, il composto EB148 porta ad un aumento del differenziamento delle MSC fin dal settimo giorno di trattamento, con un picco massimo al quattordicesimo giorno. Al contrario, il composto EB54 induce differenziamento solo al ventunesimo giorno di trattamento. L'inibitore di riferimento NUT-3 non ha evidenziato nessun effetto significativo.
Per confermare i risultati ottenuti con il saggio di mineralizzazione, abbiamo eseguito un'analisi quantitativa sull'espressione dei marker di differenziamento osteogenico tramite Real-Time RT-PCR. I risultati hanno confermato che il composto EB148 induce un aumento dell'espressione genica di Runx2 ed un aumento modesto, ma significativo, di ALP e Osx. Il composto EB54, invece, ha indotto una modesta e debole induzione dei livelli di Runx 2 e ALP senza mostrare effetti significativi sui livelli di trascritto di Osx.
L'attività pro-osteogenica del composto EB148 e del composto EB54 è stata ulteriormente valutata in presenza di una molecola capace di bloccare le attività nucleari della proteina p53. L'analisi ha dimostrato una maggiore induzione del differenziamento delle MSC ad opera dei composti EB148 e EB54 in presenza dell'inibitore di p53. Tali dati suggeriscono che gli effetti pro-differenzianti non sono legati ad una riattivazione di p53 bensì a meccanismi legati a MDM2 che non si trova legata a p53. Infatti, sebbene la proteina p53 venga riattivata dopo dissociazione da MDM2, EB148 induce un aumento del differenziamento osteogenico, attribuibile alle attività di MDM2 p53-indipendenti.
In conclusione, si può affermare che l'inibitore EB148 svolge un ruolo chiave nell'indurre l'attivazione di proteine intracellulari indispensabili nel differenziamento delle cellule staminali mesenchimali a osteoblasti.