• validazione
• test NAT
• plasmaderivati
• HEV

Recentemente è stata osservata una crescente diffusione del virus dell’Epatite E (HEV) non solo in Paesi in via di sviluppo, ma anche in Paesi in cui le buone condizioni igienico-sanitarie non farebbero pensare ad una elevata prevalenza. Questi dati hanno portato le Autorità Regolatorie ed i produttori di plasma-derivati a valutare attentamente il rischio di trasmissione di questo patogeno. A tale proposito, al fine di ridurre il rischio di trasmissione di agenti patogeni attraverso l’uso terapeutico di plasmaderivati, vengono adottate misure quali: selezione dei donatori, screening delle donazioni, tracciabilità donatori-prodotto finito e viceversa, procedure di look back, controllo plasma pool secondo test previsti da Farmacopea o definiti da standard qualitativi interni e presenza di step del processo produttivo dedicati alla inattivazione/rimozione dei virus. I processi produttivi di plasmaderivati (fattori della coagulazione, immunoglobuline, albumina, ecc.) sono caratterizzati da numerose fasi di purificazione e da step dedicati alla rimozione/inattivazione virale, efficaci nell’assicurare la clearance di eventuali contaminanti virali con diverse caratteristiche fisico-chimiche; per tale motivo si ritiene che per questi prodotti le misure attualmente presenti siano sufficienti a ridurre il rischio di trasmissione per HEV. Per un particolare prodotto, costituito da plasma sottoposto a inattivazione virale mediante trattamento solvente/detergente (efficace solo per virus con envelope), la particolarità del processo produttivo, la mancanza di dati scientifici riguardo al contributo neutralizzante di eventuali anticorpi presenti e l’impossibilità di potere inserire step efficaci per la clearance di virus non rivestiti, ha portato alla necessità di arginare il rischio per la trasmissione dell’HEV tramite l’introduzione di un test NAT specifico sul materiale di partenza. Lo scopo di questa tesi è stato quello di individuare una metodica applicabile come test di screening sui pool di plasma destinati alla lavorazione, in accordo a quanto verrà richiesto dalla Farmacopea Europea nella variazione prevista per la monografia del plasma trattato solvente/detergente. Nello studio è stata sviluppata una metodica multiplex NAT “in-house” di tipo qualitativo per la rivelazione di HEV e di un controllo interno aggiunto per evitare falsi negativi. La metodica sviluppata è stata poi confrontata con una metodica simile disponibile in commercio. Sulla base di indagini preliminari, entrambe le metodiche si sono rivelate adeguate alle disposizioni regolatorie proposte, per cui la scelta della metodica per l’introduzione del test come specifica di processo è stata effettuata principalmente in base alla semplicità di utilizzo, di validazione e di standardizzazione. Il metodo scelto è stato quello disponibile in commercio, questo è stato poi validato in accordo alla sezione 2.6.21 della Farmacopea Europea, in particolare è stata verificata la specificità, il detection limit e la robustezza.

Recently an increasing spread of hepatitis E virus (HEV) has been observed in developing Countries as well as in Countries where good sanitary conditions would not suggest a high prevalence. These data have led the regulatory authorities and manufacturers of plasma derivatives to carefully assess the risk of transmission of this pathogen. In order to reduce the risk of transmission of pathogens through the therapeutic use of plasma derivatives, safety measures have been taken, such as: selection of donors, screening of donation, traceability between donors and finished product, look back procedures, plasma pool screening according to test required by the Pharmacopoeia or defined by internal quality standards and the introduction of step in the manufacturing process specifically designed for inactivation/removal of viruses. The production process of plasma derivatives (e.g. coagulation factors, immunoglobulins, albumin, etc) are characterized by a number of purification stages and by steps dedicated to viral inactivation/removal, effective in ensuring the clearance of potential viral contaminants with different physical-chemical properties. For these reasons for this kind of products the measures adopted are considered sufficient to reduce the risk of HEV transmission. For a particular product, represented by plasma subjected to viral inactivation by solvent/ detergent treatment (known to be effective only against enveloped viruses), the peculiarity of the production process, the lack of scientific data concerning the contribution of potential neutralizing antibodies and the impossibility to insert effective steps for the clearance of non-enveloped viruses, have led the introduction of a specific NAT test on the starting material in order to limit the risk of HEV transmission.
The aim of this work was to find a suitable method which could be applied as a screening test on plasma pools subjected to processing, in accordance with what will be required by the European Pharmacopoeia in the next variation concerning the monograph for solvent/detergent treated plasma. In the study a multiplex “in-house” NAT qualitative method was developed for the simultaneous detection of HEV and an internal control inserted to avoid false negative results. The method developed was then compared with a commercially available similar method. On the basis of preliminary investigation, both methods have proved to be suitable for the proposed regulatory requirements. However, based on simplicity of use, validation and standardization, the methodology chosen for the introduction of NAT test as process specification was the commercially available method. The method was then validated according to section 2.6.21 of European Pharmacopoeia by investigating the following parameters: specificity, detection limit and robustness.