• Otx1MSC osteogenesi

Le Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs), sono cellule staminali pluripotenti capaci di differenziare in cellule del lineage mesodermico, come osteociti, adipociti, condrociti, miociti. Le MSCs risiedono principalmente nel midollo osseo, dove sono state isolate per la prima volta, e in molti altri tessuti adulti. La possibilità di differenziarsi in lineages multipli e la capacità di essere espanse ex vivo, oltre che la loro azione immunoregolatoria, le hanno rese, in questi ultimi anni, un bersaglio di studio molto interessante per la loro potenzialità terapeutica nella medicina rigenerativa e nell’ ingegneria tissutale. Tuttavia per una efficiente applicazione clinica delle MSCs è necessario comprendere più a fondo i meccanismi molecolari che ne regolano il self-renewal e la differenziazione nei diversi lineages. Molti studi sostengono l’ipotesi che cellule staminali e precursori di diversi tessuti siano regolati da meccanismi molecolari comuni. In tale ottica, nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi, si sta verificando l’ipotesi che l’omeogene Otx1, codificante un fattore di trascrizione essenziale nello sviluppo embrionale, contribuisca al controllo delle cellule staminali mesenchimali, in particolare durante il loro differenziamento osteogenico. Questo gene appartiene alla sottofamiglia degli omeogeni Otx, omologhi nei Vertebrati del gene Orthodenticle di Drosophila, e svolge una funzione essenziale nella morfogenesi del cervello e nella formazione degli organi di senso. Studi effettuati precedentemente nel nostro laboratorio hanno inoltre dimostrato che Otx1, durante la vita adulta, è coinvolto anche nella produzione delle cellule del sangue, contribuendo alla regolazione di cellule staminali e precursori ematopoietici. Dato che le MSCs e gli osteoblasti maturi costituiscono la nicchia delle cellule staminali ematopoietiche (HSCs), ovvero quel microambiente nel quale le HSCs sono localizzate, è verosimile pensare che Otx1 possa contribuire anche alla regolazione delle MSCs in particolare durante il loro differenziamento osteogenico. Una prima evidenza sperimentale ottenuta nel nostro laboratorio è fornita dall’osservazione che l’RNA messaggero di Otx1 è espresso a bassi livelli in MSCs indifferenziate e la sua attività trascrizionale è modulata durante la differenziazione osteogenica di MSCs sia umane che murine. Poiché frequentemente gli omeogeni sono regolati a livello post-trascrizionale, scopo della mia tesi è stato quello di verificare l’espressione della proteina Otx1 tramite Western-Blot, e la sua variazione durante la differenziazione osteogenica, tramite analisi di immunocitochimica. Questo studio è stato effettuato sia in una linea cellulare murina di preosteoblasti, MC3T3-E1, ampiamente utilizzata come modello sperimentale di differenziazione osteogenica, sia in colture primarie di MSCs murine allo stato indifferenziato e indotte in vitro verso un destino osteogenico. Analisi condotte tramite Western-Blot mostrano la presenza della proteina sia nella linea MC3T3-E1 che nelle MSCs primarie indifferenziate. Inoltre saggi di immunocitochimica, durante la differenziazione delle MSCs, evidenziano un aumento d’espressione della proteina Otx1 confermando quanto già riscontrato a livello del messaggero. Al fine di studiare la funzione di Otx1 nelle MSCs, ho analizzato MSCs derivate da topi mutanti knock-out, in cui il gene Otx1 è stato inattivato. Pertanto dopo aver ottenuto MSCs da topi wild type e Otx1-/-, le ho indotte a differenziare sia in senso adipogenico che osteogenico. Mediante colorazioni citochimiche (rispettivamente Oil Red e Alizarin Red), ho riscontrato che la perdita di funzione di Otx1 è associata ad una maggiore differenziazione in senso adipogenico a discapito dell’osteogenesi. Per indagare ulteriormente il ruolo che Otx1 svolge nel processo osteogenico ho effettuato analisi immunocitochimiche, valutando l’espressione di un fattore di trascrizione master dell’osteogenesi, Runx2, e di un marcatore di differenziamento terminale, l’ Osteocalcina, durante il differenziamento di MSCs wild type e knock-out. Questi risultati hanno evidenziato una significativa diminuzione dell’espressione di Runx2 e dell’Osteocalcina in cellule Otx1-/- rispetto alle normali.
In conclusione, i risultati suggeriscono che Otx1 sia coinvolto anche nella regolazione delle MSCs, in particolare durante le fasi precoci del differenziamento osteogenico.