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Tesi etd-02012006-143626
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Tipo di tesi Tesi di laurea vecchio ordinamento
Autore Mattolini, Serena
Indirizzo email serebio@katamail.com
URN etd-02012006-143626
Titolo Effetti di Elevate Concentrazioni di Glucosio su Cellule Endoteliali Aortiche Umane
Settore scientifico disciplinare SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI, FACOLTA'
Corso di studi SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
Nome Commissario Qualifica
Prof. Luca Benzi relatore
Parole chiave
  • apoptosi
  • segnale insulinico
  • endotelio
  • glucosio
Data inizio appello 2006-02-22
Disponibilità mixed
Data di rilascio2046-02-22
Riassunto analitico
RIASSUNTO

Le alterazioni metaboliche che caratterizzano il diabete, quali l’iperglicemia, l’insulino-resistenza e l’incremento dei livelli di acidi grassi liberi circolanti, inducono l’attivazione di meccanismi molecolari che, attraverso la riduzione della disponibilità di ossido di azoto (NO) e/o un aumento di stress ossidativo, contribuiscono ad alterare la funzionalità vascolare, favorendo così l’insorgenza di processi aterosclerotici che aumentano il rischio di patologie cardiovascolari. Nell’uomo livelli fisiologici di insulina agiscono come fattore vasoattivo modulando, attraverso la via PI3k-dipendente, l’espressione e l’attività dell’isoenzima ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) deputato alla sintesi di NO. L’ossido di azoto ha un ruolo importante nella regolazione della vasodilatazione e dei segnali molecolari che prevengono l’interazione di leucociti e piastrine con la parete dei vasi.
D’altra parte elevate concentrazioni di glucosio sembrano alterare la normale attivazione di eNOS e la produzione di ossido di azoto e indurre un aumento di fattori pro-aterogeni come l’Inibitore dell’Attivatore del Plasminogeno (PAI-1), di molecole di adesione come la Molecola di Adesione delle Cellule Vascolari (VCAM) ed un incremento dei livelli apoptotici. Contemporaneamente si assiste ad una diminuzione dell’attività proliferativa delle cellule endoteliali che coinvolge molecole della via MAPK-dipendente. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinare gli effetti dell’iperglicemia sulla trasmissione del segnale insulinico in cellule endoteliali umane. In particolare, è stata studiata l’espressione e l’attivazione della via PI3k-dipendente (Akt, eNOS), l’attivazione della via MAPK-dipendente (ERK1/2, p38 e JNK/SAPK) e la produzione di fattori pro-aterogeni come PAI-1 e VCAM. Parallelamente sono stati valutati gli effetti dell’iperglicemia sulla proliferazione e sull’apoptosi cellulare.
Cellule endoteliali aortiche umane (HAECs) sono state incubate per 72 h in presenza di differenti concentrazioni di glucosio (5 mM o 25 mM); come controllo osmotico sono state utilizzate cellule coltivate in presenza di mannitolo 18 mM.
Lo studio delle curve di crescita ha mostrato una generale diminuzione della crescita cellulare all’aumentare dei passaggi in coltura (T4-T6). Pertanto, per l’allestimento degli esperimenti, sono state utilizzate prevalentemente cellule agli stadi compresi tra T4 e T5.
Il trasporto del glucosio, misurato mediante l’incorporazione di 2-deossi-D-(3H)glucosio (2-DG3H), è risultato significativamente aumentato in presenza di alte concentrazioni di glucosio (25 mM). In accordo con questo risultato è stato riscontrato un incremento dell’espressione di GLUT-1.
L’analisi qualitativa e quantitativa del processo apoptotico mediante E.L.I.S.A, Laddering e TUNEL non ha rilevato variazioni dei livelli apoptotici nelle varie condizioni di incubazione. Le alte concentrazioni di glucosio non hanno modificato l’espressione di Bax e di Bcl-2, molecole coinvolte nella regolazione del processo apoptotico; inoltre non è stata riscontrata alcuna variazione dell’attivazione della poli-(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), enzima responsabile della riparazione del DNA e che viene clivato ed inattivato dalla caspasi 3 al fine di permettere il completamento dell’apoptosi.
Per l’analisi del segnale insulinico, dopo 72 h di incubazione in bassi ed alti livelli di glucosio, le cellule, private dei fattori di crescita e dell’FBS, sono state coltivate per 24 h nel loro mezzo base addizionato dell’1% di siero di cavallo (HS) mantenendo le stesse concentrazioni di glucosio e di mannitolo; successivamente le cellule sono state trattate con insulina 10-7 M per 30’, 6 e 24 h.
I livelli di espressione e/o attivazione di Akt, eNOS, ERK1/2, JNK/SAPK, p38 e PAI-1 sono rimasti invariati.
Entrambe le vie di trasduzione del segnale insulinico, PI3k-dipendente e MAPK-dipendente, sono risultate ugualmente attivate in condizioni basali e non responsive allo stimolo insulinico indipendentemente dalle concentrazioni di glucosio o mannitolo nel mezzo di coltura.
Inoltre, è emerso che il recettore per l’insulina (IR) ed il substrato 1 di tale recettore (IRS-1) non sono fosforilati dopo incubazione con insulina. Infine, nonostante il livello di espressione del recettore per il fattore di crescita insulino-simile (IGF1R) sia risultato circa 10-15 volte maggiore di quello di IR, anche IGF1R non si è dimostrato responsivo allo stimolo insulinico.
A conferma di questi dati anche l’attivazione o la produzione di fattori dipendenti sia dalla via PI3k/Akt (eNOS) che dalla via MAPK-dipendente (PAI-1) sono risultate sovrapponibili nelle condizioni basali e non hanno mostrato variazioni dopo stimolo con insulina.
È stato riscontrato invece, un aumento dell’espressione di VCAM in seguito al trattamento con insulina 10-7 M protratto per 24 h. Un successivo esperimento ha dimostrato che questo risultato è legato alla deprivazione di fattori di crescita piuttosto che all’azione dell’ormone.
In conclusione nel nostro modello sperimentale: a) l’incubazione delle cellule con alte concentrazioni di glucosio non influisce sulla crescita e sull’apoptosi cellulare; b) elevati livelli di glucosio non influiscono sulla trasmissione del segnale insulinico; c) la cascata del segnale insulinico non viene attivata dopo lo stimolo con l’ormone e, di conseguenza, non si attivano fattori proaterogeni dipendenti dal segnale insulinico; d) l’incremento dell’espressione di VCAM deriva dalla deprivazione dei fattori di crescita piuttosto che dall’incubazione cronica con insulina.
Questi risultati hanno evidenziato possibili divergenze e limiti dei modelli cellulari in vitro che, per tipo di cellula usata, modalità di incubazione, entità dello stimolo insulinico etc., non sempre possono fornire informazioni applicabili alla realtà clinica.


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