• cellule muscolari lisce
• drug eluting stents
• espressione COX-2
• iperplasia neointimale
• proliferazione
• restenosi

RIASSUNTO

INTRODUZIONE
L’aterosclerosi è un complesso processo infiammatorio cronico-degenerativo, che può alterare la struttura e la composizione della parete dei vasi arteriosi di medio e grande calibro. Esso è caratterizzato da un accumulo progressivo di lipidi, cellule (macrofagi, linfociti T e cellule muscolari lisce) e matrice extracellulare. La lesione caratteristica è l'ateroma o placca aterosclerotica, ossia un ispessimento dell'intima delle arterie, che con il tempo può causare stenosi del vaso, ovvero l’occlusione del lume dell’arteria, che è causa di infarto o ictus.
L'angioplastica percutanea con impianto di stents (protesi metalliche) rappresenta attualmente il trattamento più diffuso nell'ambito delle lesioni aterosclerotiche. Tuttavia questa procedura non è del tutto risolutiva, in quanto nel tempo, in alcuni casi si può formare tessuto cicatriziale che porta ad una nuova chiusura (restenosi). Per limitare la crescita di tessuto sono stati introdotti stents ricoperti con farmaci antitumorali o antirigetto come il taxolo o il sirolimus e i suoi derivati, che hanno ridotto il tasso di restenosi. Ma anche questo accorgimento non è esente da rischi, che possono essere anche maggiori della stessa restenosi. Infatti i farmaci antiproliferativi utilizzati, oltre a limitare la ricrescita delle cellule muscolari lisce, responsabili principali della restenosi, impediscono la proliferazione delle cellule endoteliali, necessarie invece per la rigenerazione e l’omeostasi del vaso, che rimane perciò esposto alle cellule del sangue; da qui può scaturire la formazione improvvisa di un trombo con conseguenze anche mortali.
La ricerca farmacologica in questo campo si sta muovendo per verificare se altri farmaci, in sostituzione o in associazione alle sostanze antitumorali e antirigetto usate oggi, possano portare ad eliminare del tutto il rischio di trombosi e di restenosi.

SCOPO DELLA TESI
La disfunzione endoteliale e la proliferazione e migrazione delle cellule muscolari lisce sono eventi centrali nel processo di restenosi della parete vasale.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare in vitro sulle cellule muscolari lisce da aorta umana (HAoSMCs) e sulle cellule endoteliali da vena ombelicale (HUVECs) i potenziali effetti di un nuovo composto sintetico, il 2-(3,4-dimetossifenil)-3-fenil-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-one (DB103), sintetizzato presso il Dipartimento di Farmacia (brevetto: MI201205144). Il mio lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Fisiologia Clinica, si inserisce nell’ambito del progetto di ricerca “MICROsystems for VAscular diagnosticS and inTervention” (Micro-Vast), progetto finanziato dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Pisa e a cui collaborano diversi partners, fra cui il gruppo del Dipartimento di Farmacia, che si occupa della sintesi di nuovi agenti terapeutici vascolari, ed il gruppo di biologi dell’Istituto di Fisiologia Clinica, con cui ho svolto il lavoro, che ne valuta l’efficacia.

METODI
La tossicità è stata valutata mediante il saggio WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). La proliferazione cellulare è stata valutata mediante il saggio di incorporazione del BrdU (Roche Diagnostics). L’espressione della ciclossigenasi-2 (COX-2) e della metalloproteinasi-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9) a livello trascrizionale è stata stimata attraverso la tecnica della reverse transcriptase-polymerase chain reaction.
L’espressione proteica della COX-2 è stata valutata mediante un saggio immunoenzimatico modificato da noi su cellule fissate e permeabilizzate, utilizzando un anticorpo policlonale anti COX-2 (Tema Ricerca). La valutazione del rilascio della prostaglandina-E2 (PGE2) e della prostaciclina (PGI2) è stata effettuata mediante specifici saggi immunoenzimatici (Cayman Chemical Company , Ann Arbor, Michigan, USA).

RISULTATI
Poiché il composto DB103 è strutturalmente correlato ai flavonoidi, abbiamo valutato la tossicità del nostro composto rispetto a due noti flavonoidi, l’apigenina e la quercetina. Da questo confronto è risultato che il nostro composto non è tossico sulle HUVEC, né ad alte concentrazioni, né per lunghi tempi di incubazione, mentre i due flavonoidi dopo 72 ore di incubazione non sono tollerati neanche a basse concentrazioni (10 µmol/L).
Il composto DB103, alle concentrazioni 1, 10 e 25 μmol/L, inibisce in maniera concentrazione-dipendente specificatamente la proliferazione delle HAoSMC indotta dal potente fattore di crescita piastrinico (platelet-derived growth factor, PDGF-BB) o dal diestere del forbolo (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA). Invece nelle HUVECs, DB103 non inibisce la proliferazione indotta dal fattore di crescita endoteliale (endothelial cell growth factor, ECGF) o dal PMA. Al contrario DB103 a 1 μmol/L stimola significativamente la crescita endoteliale.
DB103 inibisce l’espressione della COX-2 indotta da PDGF-BB o PMA ed il conseguente rilascio di PGE2 nelle HAoSMC. Invece nelle HUVECs non ha effetto né sull’espressione della proteina, né sul rilascio dei prostanoidi PGI2 e PGE2. Anche la trascrizione della MMP-9 è inibita da DB103 in maniera concentrazione-dipendente nelle HAoSMCs.

CONCLUSIONI
I nostri risultati suggeriscono che DB103 può essere un potenziale agente anti-proliferativo delle cellule muscolari lisce a concentrazioni fisiologiche e non tossiche.
Grazie alla sua attività cellula-specifica, DB103 inibisce la proliferazione delle cellule muscolari lisce e contemporaneamente esercita un’azione protettiva sull’endotelio vascolare. DB103 può rappresentare una valida alternativa agli attuali farmaci antiproliferativi che eluiscono dagli stent vascolari, con lo scopo di promuovere un riparo funzionale del vaso danneggiato, limitando i problemi di restenosi e trombosi.