• myocarditis
• miocardite
• infezione
• infection
• coxsackievirus B

Riassunto

L’infarto del miocardio, che è la principale causa di morbidità e mortalità nei paesi industrializzati, è causato nel 50% dei casi da cardiomiopatia dilatativa (CMD) che deriva spesso da una patologia infettiva-infiammatoria a carico del tessuto miocardico (Ellis CR et al., 2007).
Molti studi presenti in letteratura hanno rilevato la presenza di genomi virali nel tessuto cardiaco di pazienti affetti da cardiomiopatia (CM) (Liu P, et al., 2003; Lassner D et al., 2005). E’ noto infatti che alcuni virus possono essere agenti eziologici di miocarditi.
I virus maggiormente cardiotropici sono: gli Adenovirus (tipo 2 e 5) ed gli Enterovirus, in particolare i Coxsackie virus (ceppi B1-B6), meno frequentemente il Citomegalovirus (CMV), l’Epstein Barr (EBV), il virus erpetico umano 6 (HHV6), il parvovirus B19 (PVB19) (Nigro G. et al., 2000), il virus dell’epatite C (Prati D. et al., 1999). Sono stati inoltre descritti casi di miocardite virale fulminante da Herpes simplex 1 (HSV-1) ed EBV (Koga et al.,2001, Takaki I. et al., 2005).
Il meccanismo patogenetico d’infezione del miocardio da Adenovirus ed Enterovirus è stato in parte chiarito (Bergelson JM et al., 1997; Tomko RP et al., 1997) con la scoperta del recettore CAR (coxsackie and Adenovirus receptor) e del corecettore DAF (decay-accelerating factor) espressi sulle cellule cardiache.

Il recettore CAR è una proteina del peso molecolare di 46-kDa appartenente alla famiglia delle immunoglobuline ed espresso prevalentemente sui dischi intercalari delle cellule cardiache umane. Il corecettore DAF, del peso molecolare di 70 k Da, è una proteina regolatoria del complemento espressa sulla superficie delle cellule epiteliali ed endoteliali (Selinka H-C et al., 2004). I due recettori sembrano avere attività sinergica per l’ internalizzazione virale con conseguente vantaggio nella replicazione e diffusione sia in senso verticale che orizzontale all’ interno dei tessuti; inoltre l’ effetto sinergico degli anticorpi anti-CAR e anti-DAF suggerisce l’ esistenza di un’ associazione spaziale delle due proteine a formare un CAR-DAF receptor complex (Martino et al., 1998; Liu P. et Opavsky, 2000).
Secondo recenti studi il CAR-DAF Receptor Complex consentirebbe la penetrazione del virus nelle cellule anche mediante transcitosi (Selinka HC et al., 2004), un tipo di pinocitosi utilizzata dagli organismi pluricellulari per trasportare selettivamente macromolecole tra i due ambienti delimitati da una cellula polarizzata, ad esempio tra la superficie apicale e basolaterale di una cellula epiteliale. E’già stato evidenziato in precedenza il fatto che un virus cardiotropico debba attraversare un gran numero di differenti cellule e tessuti, che esprimono ciascuno particolari e specifiche proteine recettoriali, prima di raggiungere la destinazione finale delle cellule cardiache, i miociti. Le barriere epiteliali e quelle endoteliali possono dunque essere superate attraverso un’infezione virale o mediante transcitosi del virus. Una riespressione della proteina CAR è stata ben documentata in molte patologie cardiache, quali le miocarditi virali, e potrebbe essere interpretata come un pattern di riespressione embrionale che è stato infatti accertato per molte proteine coinvolte nelle patologie cardiache gravi. Questa riespressione del recettore CAR causerebbe un riassortimento strutturale del miocardio e soprattutto aumenterebbe la suscettibilità all’infezione virale (Poller W et al., 2002).
Le basi molecolari del tropismo cardiaco e del meccanismo patogenetico delle miocarditi causate da CMV, EBV, HHV6, PVB19 e HCV sono ancora ignote.
L’analisi epidemiologico-molecolare dei casi di miocardite virale ha evidenziato che, come per tutte la infezioni virali, soggetti diversi hanno evoluzione clinica infettiva diversa, che potrebbe essere in parte dovuta, nei casi di infezione con virus coxsackie ed adeno, all’espressione transitoria del recettore CAR. E’ noto inoltre che esistono soggetti geneticamente resistenti alle infezioni (Velioy VM, 2005; Abdel-Azim et al., 2005).
Nonostante i continui progressi raggiunti negli ultimi anni nella conoscenza dei meccanismi molecolari e cellulari della fisiopatologia cardiaca, ad oggi, mancano trattamenti farmacologici risolutivi in grado di preservare le cellule cardiache contrattili danneggiate durante l’infarto. Pertanto l'unico trattamento possibile per curare questa patologia è rappresentato dal trapianto d’organo o impianto di cellule staminali (Forte G et al., 2009).
Allo scopo di selezionare cloni eventualmente resistenti all’ infezione da virus cardiotropici, da poter poi espandere e perfondere al momento del bisogno, sono state acquisite cellule staminali cardiache adulte murine ingegnerizzate con la sub unità catalitica delle telomerasi, c-tert, sviluppate nel laboratorio di Cardiologia Molecolare e Cellulare, Università di Torvergata Roma. Tali cellule non manifestano ne’ senescenza ne’ differenziamento. Considerando che i mioblasti midollari umani risultano suscettibili di infezione con Adenovirus (Kohtz DS, et al., 1991), è stata saggiata la suscettibilità delle cellule staminali acquisite all’infezione con una miscela di isolati di enterovirus umani coxsackie B1-B6 (ceppi vaccinali di riferimento) principali cause di miocardite ad eziologia virale e a seguire con i singoli ceppi B1, B2, B3, B4, B5, B6, per ovviare a fenomeni di interferenza virale o maggiore suscettibilità ad uno dei ceppi utilizzati, alla concetrazione di 100 dosi citopatiche al 50% in 75l e cinque diluizioni seriali in base 10. Come controllo positivo è stata utilizzata la linea cellulare KB (Human Epidermoid Carcinoma, Istituto Zooprofilattico Bruno Ubertini), che è permissiva e competente all’infezione da enterovirus ed esprime il recettore CAR (Terletskaia-Ladwig et al., 2008). E’ stata verificata l’espressione del recettore CAR come mRNA mediante RT-PCR e PCR con primer specifici (Sollerbrant et al., 2007) e successivamente la sua presenza come proteina sulle cellule mediante saggio immunoenzimatico.
Dopo 48, 72 e 96 ore dall’infezione è stato ricercato il genoma virale nel surnatante e nelle cellule separatamente mediante RT- PCR e Nested PCR utilizzando primer all- entero (Simmonds et al., 2009). E’ stata valutata l’espressione di antigeni virali mediante IFA indiretta.
Risultati:
• Il recettore CAR è espresso come RNA e tradotto come proteina nella linea staminale c-tert.

• Le linee staminali c-tert non hanno mostrato alcun effetto citopatico a tutti i tempi dall’infezione e a tutte le diluizioni, al contrario della linea cellulare KB che già dopo 48 ore presentava segni di morte cellulare.

• L’analisi molecolare ha confermato la presenza del genoma virale all’interno della linea c- tert infettata sia con la miscela dei 6 ceppi che con i ceppi singoli, pressocchè a tutti i tempi dell’infezione analizzati e alle prime diluizioni utilizzate, così come nel controllo positivo, la linea cellulare KB.

• Il genoma virale rilevato nel surnatante delle colture della linea KB, non è stato rilevato nei surnatanti di nessuna delle colture della linea c- tert infettate.

• L’analisi mediante IFA ha confermato che gli antigeni virali sono espressi nella linea di controllo KB ma non nelle colture della linea c- tert.

I risultati ottenuti sembrano dimostrare che:

• le cellule staminali cardiache c-tert siano permissive nei confronti dei ceppi vaccinali di Coxsackie virus B1-B6, in quanto il virus penetra all’interno delle cellule, che risultano quindi positive per il genoma virale;

• le cellule staminali cardiache c-tert non sarebbero competenti, ovvero non disporrebbero di un adeguato macchinario biosintetico e molecolare che permetta al virus di replicarsi attivamente. Il genoma virale, infatti, non si ritrova nel surnatante delle colture infettate ne’ quest’ultime esprimono antigeni virali sulla superficie cellulare.

Le prospettive future sono:

• Un possibile impiego della linea cellulare c-tert per terapia cardiomiocitica sostitutiva nel modello di infarto sperimentale murino.

• L’ analisi del pattern di espressione di geni coinvolti nel pathway infiammatorio ed apoptotico della linea staminale c-tert, in seguito ad infezione virale, mediante microarray dedicati, al fine di analizzare il meccanismo molecolare di interazione virus-cellula.