• anticorpi monoclonali anti-EGFR
• KRas
• BRAF
• resistenza
• proliferazione
• analisi mutazionale
• tre prelievi

1. RIASSUNTO


Introduzione
Nei paesi occidentali il tumore del colon-retto è uno dei più diffusi e rappresenta la terza causa di morte dovuta a neoplasie maligne. Sebbene negli ultimi anni si è assistito ad un aumento dell’incidenza dei tumori del colon-retto, è stata comunque riscontrata una concomitante diminuzione della mortalità ad esso dovuta, attribuibile soprattutto ad una adeguata prevenzione, ad una diagnosi precoce e all’utilizzo di terapie farmacologiche mirate, il cui sviluppo è stato possibile grazie ad una conoscenza più approfondita della biologia di tali tumori.
In particolare, negli ultimi anni, per il trattamento dei tumori del colon-retto, è stata messa a punto una strategia terapeutica basata sulla somministrazione di anticorpi monoclonali (mAb) rivolti verso il recettore per il fattore di crescita epiteliale (EGFR). Tale recettore controlla la cascata di trasduzione del segnale Ras-RAF-MAPKasi e mediante l’attivazione di diversi effettori molecolari, tra cui KRas e BRAF, regola numerosi processi cellulari quali la crescita, la differenziazione, la migrazione cellulare e l’apoptosi. Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato che alterazioni a carico del recettore EGFR e/o degli effettori da esso attivati sono coinvolte nell’iniziazione e nella progressione tumorale promuovendo meccanismi di resistenza all’apoptosi, proliferazione cellulare, angiogenesi e processi di metastatizzazione.
In recenti studi è stato osservato che il trattamento con mAb anti-EGFR è efficace soltanto nel 10-20% dei casi e la resistenza a tale trattamento è stata associata alla presenza di mutazioni a carico dei geni KRas e BRAF che determinano l’attivazione costitutiva delle proteine da essi codificate, con conseguente induzione della cascata Ras-RAF-MAP-Kasi indipendente dalla stimolazione del recettore EGFR. In particolare le mutazioni di KRas e BRAF sono state descritte con una percentuale pari al 30-40% e 5-15% rispettivamente.
La determinazione dello stato mutazionale di tali geni ha, dunque, assunto un ruolo essenziale nell’identificazione dei pazienti affetti da carcinoma al colon-retto che possono essere trattati.

Obiettivo
Per la diagnosi istologica dei tumori del colon il campionamento del pezzo operatorio viene eseguito effettuando 3 prelievi in diverse aree stabilite della massa tumorale.
Lo scopo del mio lavoro è stato, dunque, quello di verificare se l’analisi mutazionale effettuata su un unico prelievo possa essere sufficiente a definire lo stato mutazionale del tumore nel suo complesso.

Materiali e metodi
L’analisi mutazionale dei codoni 12 e 13 del gene KRas e dell’esone 15 del gene BRAF è stata eseguita su prelievi effettuati in tre regioni differenti dello stesso tumore. Tale analisi è stata eseguita su DNA estratto mediante microdissezione manuale da tessuto tumorale del colon fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) mediante le tecniche di PCR, SSCP e sequenziamento genomico diretto.

Risultati
L’analisi mutazionale dei codoni 12 e 13 dell’esone 2 del gene KRas e dell’esone 15 del gene BRAF è stata eseguita su 20 casi, per ciascuno dei quali sono stati analizzati tre prelievi.
Dall’analisi mutazionale di KRas, dei 20 casi di carcinoma colorettale analizzati, 14 (70%; 14/20) sono risultati essere wild-type nei tre prelievi esaminati, mentre 5 casi (25%; 5/20) sono risultati essere mutati, in tutti e tre i prelievi. In particolare, di questi ultimi, 4 (80%; 4/5) sono risultati essere mutati a carico del codone 12 per il quale sono state riscontrate le mutazioni G12V e G12D in uno (25%; 1/4) e tre casi (75%; 3/4), rispettivamente; mentre un caso (20%; 1/5) presentava la mutazione G13D a carico del codone 13. In uno di questi 20 casi (5%; 1/20) per ciascun prelievo è stato osservato uno stato mutazionale differente e nello specifico un prelievo è risultato essere wild-type, uno mutato G12V, mentre il terzo è risultato essere mutato per il codone 13 (G13D).
Dall’analisi mutazionale dell’esone 15 del gene BRAF per ciascun caso è stata osservata la concordanza dello stato mutazionale nei tre prelievi, in particolare 19 casi dei 20 analizzati sono risultati essere wild-type, mentre in un caso è stata riscontrata la mutazione V600E.

Conclusioni
Mentre i dati ottenuti dall’analisi mutazionale del gene BRAF hanno dimostrato che l’analisi eseguita su un unico prelievo è sufficiente a definire lo stato mutazionale di tale gene nell’intero tumore, dai risultati ottenuti dall’analisi mutazionale del gene KRas sembrerebbe, invece, che l’analisi molecolare eseguita su un unico prelievo non sia sufficiente a definire lo stato mutazionale del tumore nel suo complesso.