• embriogenesi e organogenesi avventizia
• epifillia
• totipotenza
• fattore di trascrizione

La regolazione dell’embriogenesi vegetale, divisa concettualmente in una fase morfogenetica e in una fase di maturazione del seme, avviene grazie all’espressione di tre classi geniche distinte. Geni quali WUSCHEL, SHOOT ROOT, SHOOTMERISTEMLESS, SCARECROW appartenenti alla prima classe, essenziali per la formazione dei meristemi apicali (radicale e caulinare), regolano la fase morfogenetica mentre una seconda classe agisce sulla maturazione del seme. Altri geni, Leafy Cotyledon1 (LEC1), Leafy Cotyledon1-LIKE (L1L), LEC2 e FUSCA3, raggruppati in un terzo gruppo, hanno la priorit&agrave di controllare entrambe le fasi embrionali, pressuponendo quindi un loro ruolo chiave nella gerarchia genica di queste proteine regolatrici.
LEC1 e L1L codificano per la subunit&agrave HAP3 di un fattore di trascrizione che lega una sequenza CCAAT-Box. Studi su A. thaliana hanno messo in evidenza un’omologia di sequenza tra questi geni per ciò che concerne il loro dominio centrale altamente conservato, ipotizzando anche una conservazione di tipo funzionale. Il gene LEC1 conferisce caratteristiche tipiche embrionali ed induce, quando &egrave espresso ectopicamente, la formazione di embrioni somatici da cellule vegetali differenziate.
Lo scopo della presente tesi &egrave quello di valutare l’espressione del gene L1L nell’embriogenesi di Helianthus annuus e il suo coinvolgimento nei fenomeni epifillici manifestati, in assenza di trattamenti ormonali, dal variante somaclonale (EMB-2) isolato dalla rigenerazione in vitro dell’ibrido interspecifico tetraploide (2n = 4x = 68) Helianthus annuus x Helianthus tuberosus. Il cDNA del gene Leafy Cotyledon1-LIKE &egrave stato isolato per mezzo delle tecniche di RT-PCR e 5’/3’ RACE utilizzando RNA totale estratto da embrioni immaturi di H. annuus. Il sequenziamento del cDNA ha permesso di scegliere oligonucleotidi per amplificare la sequenza genomica corrispondente e, nella regione 3’ UTR, oligonucleotidi specifici per una sonda in grado di distinguere il gene L1L dal gene LEC1. La sonda a RNA, utilizzata in esperimenti di ibridazione in situ, ha consentito di evidenziare le caratteristiche di espressione del gene HaL1L nell’embriogenesi zigotica di H. annuus. In particolare, &egrave stato osservato che il gene HaL1L &egrave altamente espresso negli stadi precoci dell’embrione zigotico (5 giorni dalla data di fecondazione) mentre la sua attivit&agrave si riduce negli stadi più tardivi (10 giorni dalla data di fecondazione). Al contrario, il livello di espressione nei tessuti materni (tegumenti del seme, nucella e sacco gametofitico) rimane elevato per tutti gli stadi embriogenetici analizzati. La riduzione dell’espressione di HaL1L, negli stadi più avanzati di sviluppo dell’embrione zigotico, &egrave stata confermata dall’analisi mediante RT-PCR relativa. Con tale tecnica &egrave stata peraltro dimostrata la bassa o assente espressione del gene in altri organi e/o tessuti (cotiledoni, foglie, radici, fusto e infiorescenze immature). L’ibridazione in situ non ha al momento evidenziato l’attivit&agrave del gene HaL1L nei fenomeni epifillici espressi dal clone EMB-2. Tuttavia, le prove di RT-PCR mostrano che il livello di espressione di HaL1L &egrave molto basso nei germogli epifillici ed elevato negli embrioni somatici ectopici, a dimostrazione del coinvolgimento di questo gene sia nell’embriogenesi zigotica sia somatica.