• L1L
• metilazione
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• regolazione genica
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La regolazione dell'embriogenesi zigotica nelle piante avviene grazie all’espressione di tre classi geniche distinte: alla prima classe, che regola la fase morfogenetica, appartengono geni quali WUSCHEL (WUS), SHOOT MERISTEMLESS, SHORT-ROOT e SCARECROW che risultano essenziali per la formazione dei meristemi apicali (radicale e caulinare), mentre una seconda classe, comprendente fra gli altri i geni ABSCISIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3), ABI4 e ABI5, agisce sulla maturazione del seme. Altri geni, LEAFY COTYLEDON1 (LEC1), LEAFY COTYLEDON1-LIKE (L1L), LEC2 e FUSCA3, raggruppati in un terzo gruppo, hanno la proprietà di controllare entrambe le fasi embrionali, presupponendo quindi un loro ruolo chiave nella gerarchia genica di queste proteine regolatrici. LEC1 e L1L codificano per la subunità HAP3, o NF-YB, di un fattore di trascrizione, NF-Y, che lega una sequenza CCAAT-Box. Studi in Arabidopsis thaliana hanno evidenziato un’omologia di sequenza del dominio centrale altamente conservato, ipotizzando peraltro una conservazione di tipo funzionale.
L’obiettivo della presente tesi è stato quello di analizzare, durante l’embriogenesi di Helianthus annuus, l’attività trascrizionale del gene HaL1L, e iniziare uno studio sui sistemi di controllo della sua espressione. In particolare, è stato valutato l’eventuale coinvolgimento di un meccanismo operato dalla metilazione delle citosine presenti nella regione del promotore.
In una prima fase del lavoro, la sequenza nota del cDNA ha permesso di scegliere oligonucleotidi specifici per amplificare una regione del 3’UTR che ha costituito una sonda in grado di distinguere il gene HaL1L da altri geni della classe HAP3. La sonda a RNA, utilizzata in esperimenti di ibridazione in situ (ISH) ha consentito di evidenziare le presenza e distribuzione dell’mRNA codificante per HaL1L durante lo sviluppo dell’embrione zigotico di H. annuus. In particolare, è stato osservato che il trascritto di HaL1L è presente in quantità maggiore negli stadi precoci dell’embriogenesi (stadio globulare e a cuore) che negli stadi più tardivi (stadio cotiledonare, 10 giorni dalla data di impollinazione). Al contrario, nei tessuti materni (tegumenti del seme e cellule del tappeto) l’RNA rimane abbondante per tutti gli stadi embriogenici analizzati.
I dati ottenuti con l’ISH sono stati confermati, negli stadi più avanzati di sviluppo dell’embrione, dall’analisi mediante RT-PCR semiquantitativa. Con tale tecnica è stata peraltro dimostrata la bassa o assente attività trascrizionale del gene HaL1L in altri organi e/o tessuti (cotiledoni, foglie, radici, fusto e infiorescenze immature).
Si è quindi proceduto al completo isolamento di HaL1L, per mezzo della tecnica 5’/3’ RAGE, e alla successiva analisi della distribuzione di citosine metilate in due “isole CpG” (Is1 e Is2), individuate nella regione del promotore.
L’analisi dei siti sottoposti a metilazione è stata condotta tramite il trattamento con sodio bisolfito, che opera la conversione chimica delle sole citosine non metilate in uracile, mentre lascia immutate le citosine metilate.
Con l’analisi effettuata sono stati identificati nell’Is1 residui di citosina che rappresentano potenziali siti di metilazione differenziale. Infatti alcune citosine nel DNA dell’embrione di cinque giorni di sviluppo, sono sostituite da timine dopo il trattamento con sodio bisolfito, mentre non lo sono nel DNA delle foglie. Questi risulti preliminari suggeriscono che la metilazione della regione promotrice possa essere uno dei meccanismi di controllo della regolazione di HaL1L.
Alcune interessanti osservazioni sono scaturite dall’analisi della sequenza nucleotidica. Sono stati infatti individuati in particolare siti di legame per fattori proteici di regolazione come ad esempio WUS, o ABSCIC ACIDS RESPONSE ELEMENT (ABRE) e AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) che indicano un controllo della trascrizione anche di tipo ormonale. Infine, un meccanismo di controllo sulla traduzione del mRNA può essere suggerito dalla presenza di un motivo di poliadenilazione citoplasmatica all’estremità 3’ del trascritto.